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河南省人免疫缺陷病毒流行株的基因亚型分析 |
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1次PCR反应，条件为：95℃ 1分钟变性；94℃ 30秒，55℃ 30秒，72℃ 120秒，30个循环；72℃ 10分钟，取十分之一PCR产物，以env-C/env-k为内侧引物，按上述条件进行第2次PCR，扩增env基因C2-V3区。
表1 PCR和测序引物
引物 用途 序 列 在env基因
的定位
env-L PCR TGGGGTACCTGTGTGGAAA 192
env-i PCR TATCCCTGCCTAACTCTATT 2056
env-k PCR GCCCATAGTGCTTCCTGCTGCTCC 1536
env-C PCR CCAATTCCCATACATTATTG 607
env-D3 Seq CTGTTAAATGGCAGTCTAGCAG 782
env-f2 Seq GTGGAGGGGAATTTTTCTACTG 1109
四、PCR产物的纯化
PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，与marker对照判定无误后，切下特异扩增带，用Qiagen公司的Qiaex试剂，按说明提纯扩增的HIV-1 DNA片断，回收得的DNA溶于10mmol/L Tris-HCl(pH8.7)，经琼脂糖凝胶电泳与分子量标准比较估算核酸浓度。
五、核苷酸序列测定
分别使用env-D3和env-f2(见表1)为测序引物，以提纯的PCR产物为模板，用ABI公司的荧光标记末端中止物循环测序试剂盒，在PE公司9600型PCR仪上进行测序反应，模板用量约1μg，引物用量为6pmol。反应产物经提纯后用自动DNA序列分析仪进行序列测定。
六、序列分析
测得的序列用SeqEd和DNA软件进行编辑校正，每个样品C2-V3区核苷酸的最终序列根据两个同向测序引物所测结果重叠校正后确定。序列的排列、比较和同源性分析，使用威斯康星GCG公司软件完成，具体包括：(1) 用Piluep程序对样品及国际标准序列的排列和比较；(2) 用Pretty程序计算一组序列的公享序列(consensus sequence)；(3) 用distance计算一组序列之间的基因离散率；(4) 用groutree程序做系统树(phylogenetic tree)。
结果
对20份可用于序列测定的HIV-1 env基因目的片段PCR产物，经引物env-D3与env-f2进行序列分析，测定envC2-V3及其相邻区的450个碱基长的核苷酸序列，对该段DNA对应的氨基酸序列进行多种分析，用GCG软件包Pileup和Pretty程序计算其共享序列，得到同源序列，见图1。将样品的序列分别与国际A-E亚型的共享序列进行比较，并用distance程序计算相互间的基因离散率，发现样品相互间的平均离散率为3.44%，与国际B亚型共享序列间相距较近(7.8%)，与云南流行株距离最近，在8.34%左右，而与A、C、D、E亚型共享序列间的离散率均在23%以上(离A亚型23.88%，离C亚型27.37%，离D亚型24.65%，离E亚型25.03%)。进一步的系统树分析也显示，该批样品与YN-B和B聚集在一起，而与其它国际亚型距离很远，见图2。
HEN-为样本，A，B，C，D，E-CON为国际代表株，HEN-BCON为河南样本B亚型代表株，96YN-BCON为云南B代表株，Consensus为共享序列
图1 河南省HIV-1毒株C2-V3区的氨基酸序列及其共享序列
图2 河南省HIV-1B亚型毒株的系统树分析
讨论
通过对20例HIV-1阳性感染者PBMC中HIV-1 env-C2-V3及其邻近区序列进行分析后说明河南省存在B亚型的HIV-1毒株的流行。从本研究中HIV-1基因离散率的结果来看，样品间的基因离散率为3.44%，其外膜蛋白的V3环内变化也很小，根据HIV-1毒株基因平均每年以0.5%～1%［5，6］的速度变异速度计算，可以认为B亚型毒株在河南省内的流行时间大约在3～6年之间。
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