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脑出血大鼠脑内胚胎神经干细胞移植的运动神经功能改变和形态学研究 |
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制作：10％的水合氯醛腹腔内注射麻醉后，立体定向仪固定大鼠；以前囟为中心，右侧旁开3.0mm，硬脑膜开始深6.0mm定位右侧尾壳核；将3μl配好的含0．25U/μl IV型胶原酶注入尾壳核。
1.3 神经干细胞准备：①NSCs单细胞悬液制作：培养6天后神经球［2］，经0.02％EDTA消化成单细胞悬液，0.4％台盼蓝染色计数，调整密度2.0×107/100μl；②移植前20min细胞进行Hochest染色标记；
1.4 实验分组：单纯脑出血组（A组，10只），脑出血＋培养液移植组（B组，10只），脑出血＋NSCs移植组（C组，10只）。
1.5 移植：脑出血术后3天，立体定向仪固定大鼠后，将5μl单细胞悬液注入相应大鼠患侧尾壳核内，等量培养液注入对照组，约10min注射完，留针10min。
1.6 神经功能学评分：各组大鼠分别在移植前1h，移植后7天，14天，21天，28天参考Rosenberg GA［3］进行神经功能学评分：①有无自发性向血肿同侧“划圈样”行走现象，从0级(无转圈)到3级(持续转圈)进行分级；②将大鼠的左侧后肢向外拉2～3cm，观察其收缩情况，从0级(立即收缩到原位)到3级(在数秒后收缩到原位或无收缩)进行分级；③通过2.4×80cm窄木条的能力，从0级(顺利通过)到3级(在木条上站立＜10s)进行分级；将3种检查的分级分数相加，即为该大鼠的运动功能评分(0～9分)。
1.7 荧光免疫组织化学检测：移植术后第4周，神经功能学评价后将3组（A、B、C）各取3只大鼠脑组织进行NeuN、GFAP荧光免疫组织化学染色检测，简要步骤如下：①新鲜的脑组织快速制作成10μm冰冻切片；②加一抗NeuN(1:200）、GFAP(1:50)各100μl4℃过夜；③PBS冲洗后，加二抗FITC抗鼠IgG（1：100）、Cy3抗兔IgG(1:200) 各100μl室温下避光45分钟；④PBS冲洗后封片，在330～380nm，450～490nm及510～540nm波长荧光显微镜或者激光共聚焦显微镜下观察拍照。
1.8 统计学方法：所有数据经SPSS 13.0软件包统计学处理，计量资料结果以均数±标准差(x－±s)表示。组内两两比较有无显著差异根据结果选择LSD_t或者Dunnett_t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 NSCs培养及鉴定：经6天培养后，NSCs分裂增殖形成由数十个至数百个细胞构成的神经细胞球（见图1a，在封底），达到移植要求数量。神经细胞球贴壁2h后，nestin抗体鉴定显示强烈绿色荧光（见图1b，在封底），证明为神经干细胞。
2.2 神经功能学评价：见表1。表1 神经功能学评分（改善分值）注：移植后21天，与A、B组比:*P＜0.01；移植后28天，与A、B组比:＃P＜0.01
2.3 荧光标记NSCs观察：荧光显微镜观察可见大量Hoechst标记的蓝色细胞核，证实了Hoechst33342标记NSCs在大鼠脑内存活，细胞从注射部位向上下迁移并分布于整个损伤处的附近，移植细胞主要分布于血肿腔的周边。见图2a、2b，在封底。
2.4 移植NSCs在大鼠脑内分化情况：用hoechst同NeuN及GFAP的免疫荧光双标了解移植细胞的分化情况。结果中hoechst阳性细胞细胞核呈蓝色,NeuN阳性细胞标记FITC,呈绿色,两者重合的地方即表示移植的细胞分化为神经元；GFAP阳性细胞用cy3标记显色,表现为红色,其与hoechst标记的蓝色细胞核交叠的部分即是双标阳性,表示移植细胞分化成星形胶上一页 [1] [2] [3] [4] [5] 下一页
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