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细胞增殖的检测及临床意义 |
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刘迂 何泽生 吴金生
细胞动力学是研究细胞群体内各部分细胞运动规律的学科。肿瘤的细胞增殖研究早期工作由于受方法学的制约主要限于实验肿瘤，随着分子生物学的飞跃发展和免疫组织化学技术的改进，多种与细胞增殖有关的生物标志物得以发现并逐渐有了深入地认识，检测方法不断更新。现已发现许多肿瘤的细胞增殖状态与生物学行为及预后有密切关系［1］，内窥镜及针吸活检技术的普及使在治疗前了解肿瘤的增殖状态成为可能，近年来已有许多关于肿瘤细胞增殖与临床病理关系的研究。在回顾这个问题之前有必要简述细胞周期的概念，细胞群体分为增殖细胞和非增殖细胞，前者的细胞周期划分为G1、S、G2、和M期，后者包括终末细胞和暂时静止细胞。肿瘤的生长部分即为肿瘤群体中的增殖细胞，增殖检测就是确定该部分占全部肿瘤细胞的比值。在过去研究中检测细胞增殖的方法有多种，有丝分裂记数和3H胸腺嘧啶（3H-thymidine，3H-TDR）自显影是传统的方法，有丝分裂记数因受多种条件限制和主观因素较强而有一定局限性，3H-TDR放射自显影可准确地测定S期细胞，但由于放射性污染和对实验条件要求较高而主要用于实验肿瘤的研究。流式细胞仪(Flowcytometry,FCM)测定肿瘤DNA倍体及S期细胞在预示肿瘤生物学行为和判断预后有重要价值，但设备及药品昂贵不能广泛推广。细胞增殖相关抗原的单克隆抗体(Monoclonal antiboddy,MoAb),近年来已应用于肿瘤的增殖检测，本文就这方面的研究做一归纳。
1 细胞增殖标志物
增殖细胞S期DNA合成时摄取溴化脱氧嘧啶(Bromo deoxy uridine,BrDU)，由于没有放射性同位素的污染已取代3H TDR进行活体掺入法，手术前数小时静脉注入BrDU称为体内掺入法，手术后经标本血管进行含有BrDU人工血液灌注或活体细胞培养称为体外掺入法。抗BrDUMoAb可特异地和细胞核内掺入的BrDU结合而准确地检测S期细胞。但是由于BrDU掺入需要在新鲜的活体组织或细胞进行，所以限制了在临床的广泛应用。BrDU大剂量长时间体内用药可产生杀细胞作用和诱发癌变，当前主要用于活检组织的体外掺入［2］。
Ki67是细胞增殖期DNA复制时所需的345KD的蛋白质，它的功能尚不清楚，近期的研究推测它可能是核基质成分。Ki67蛋白在G1晚期开始出现并在S、G2和M期持续存在，但在G0期细胞和G1早期不表达［1］。Ki67MoAb只能用于新鲜冰冻组织从而限制了使用。Ki67蛋白的基因已经克隆，近年来用基因重组的方法发明了三种MoAb，可以和Ki67蛋白的抗原决定簇特异性结合，其优点在于可用于福尔马林固定石蜡包埋的组织，其中MIB-1和MIB-3要在染色前经微波烤箱加温切片以使抗原复性。MIB-1在细胞增殖各期均可表达。P105是和Ki67类似的增殖细胞核蛋白，它的MoAb780-3在冰冻组织和石蜡包埋组织均可使用，P105蛋白也是细胞增殖各期表达但在G2、M期达到高峰［3］。
增殖细胞核抗原(Proliferatingcellnuclearantigen，PCNA）是细胞核内36KD的酸性蛋白质，做为DNA聚合酶（DNApolymerase，DNA-P）δ的辅助蛋白，它的合成直接和细胞的DNA复制成正比，DNA-Pα、δ和PCNA形成巨大复合物在DNA复制过程中起关键作用。PCNA的合成出现在G1晚期，在S期达到高峰在G2期开始下降［4］。现在已有11种PCNAMoAb,PC10使用最广泛的，另一种应用较多抗体是19A2,这两种抗体即可用于新鲜冰冻组织，又可用于石蜡包埋组织，而实际主要用于石蜡包埋组织的研究，适用于回顾性分析。
DNA-Pα存在于真核细胞核内，其生物活性与细胞核DNA复制及细胞分化再生呈正相关，是核染色质DNA的主要复制酶，以前的研究已证明此酶在增殖细胞的G1、S和G2期的细胞核内和M期的胞浆内表达，在G0期细胞检测不到［5］。许多肿瘤细胞和正常组织,如胸腺和再生的肝脏DNA-Pα处于高水平状态［6］。到目前为止DNA-PαMoAb只能用于新鲜冰冻组织而没有用于福尔马林固定石蜡包埋组织的报道。
2 检测方法
FCM工作原理是将标本制成单细胞悬液，MoAb与细胞增殖标志物结合，特异性荧光染料标记的第二抗体与MoAb反应后使增殖标志物染色，当单个细胞经过样品室与光源相交时，被激发的荧光染料分子能放出荧光信号，经探测转换后经计算机自动分析确定荧光标记细胞比例。FCM可[1] [2] 下一页
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