cells against NDV modified SGC7901 cells was the strongest. Biotherapy for stomach cancer was better than that of chemotherapy.
[KEY WORDS] stomach neoplasms; antigens, neoplasm; immunotherapy; dendritic cells; killer cells; newcastle disease virus
目前，胃癌仍采取以手术为主的综合治疗，疗效差。近年来细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK细胞)作为杀伤肿瘤的效应细胞引起了人们极大的关注[1]。此外树突状细胞(DC)是目前已知体内抗原递呈能力最强的抗原递呈细胞，具有独特的抗原提呈和激发功能，在肿瘤细胞和T淋巴细胞的相互作用中起桥梁和枢纽作用[2]。新城疫病毒(NDV)可通过多种机制作用于肿瘤细胞，其中之一是修饰肿瘤抗原，使肿瘤细胞隐含的抗原发生外露。本研究体外通过NDV使胃癌细胞SGC7901的抗原显露后，研究效应细胞(DCCIK)对胃癌细胞的杀伤作用。
1 材料与方法
1.1 材料
EPICS XL型流式细胞仪(美国COULTER公司)，17550型酶标仪(AUSTRLA)。基因重组人干扰素γ(IFNγ，购自上海生物制品所)，抗CD3单抗(购自武汉博士德生物公司)，重组人白细胞介素2(IL2，购自北京远策药业有限公司)，重组人粒巨噬细胞集落刺激因子(rhGMCSF，购自厦门特宝生物工程股份有限公司)，重组人白细胞介素4(rhIL4，购自北京军事医学科学院)，淋巴细胞分离液(Ficoll，购自中国医学科学院生物工程研究所)。
1.2 方法
1.2.1 冻融法制备SGC7901细胞抗原 消化收集对数生长期的SGC7901细胞，用PBS液离心洗涤两次，再用PBS液重悬为1×1010/L，封装入冻存管。置液氮内冷冻10 min，取出后立即置37 ℃水浴10 min，重复3次。然后，以10 000 r/min离心30 min，取上清液-20 ℃保存备用。齐鲁医学杂志2010年10月第25卷第5期 Med J Qilu, October 2010, Vol.25, No.5
1.2.2 DC的诱导和扩增 取健康献血者50 mL肝素抗凝外周血用Ficoll密度梯度离心，分离单个核细胞。用含体积分数为0.10胎牛血清的RPMI1640培养液调整细胞密度为2×109/L，然后以每孔1 mL加入24孔培养板中，置37 ℃、体积分数0.05 CO2恒温箱培养2 h。收集非黏附性细胞于50 mL离心管中，用于诱导CIK细胞。在留有贴壁细胞的24孔板中，每孔加入含有200 μg/L的rhGMCSF和106 U/L rhIL4的RPMI1640培养液1 mL，置于37 ℃、体积分数0.05 CO2条件下培养，每3 d半量换液，同时补足上述rhGMCSF及rhIL4。观察DC培养过程中的形态变化情况。
1.2.3 DC负载胃癌抗原 于DC培养第5天每孔加50 μL肿瘤抗原(胃癌细胞裂解液)，然后继续培养48 h。DC培养第6天加入TNFα(106 U/L)。
1.2.4 CIK细胞的诱导和扩增 将上述诱导DC时收集非贴壁细胞，用含体积分数0.10胎牛血清的RPMI1640培养液调细胞密度为3×108/L，同时将IFNγ(106 U/L)每孔1 mL加入24孔培养板中，置37 ℃、体积分数0.05 CO2恒温箱中培养24 h后再加入抗CD3Ab(25 mg/L)、IL2(109 U/L)。每3 d半量换液，同时补足抗CD3Ab及IL2。
1.2.5 DC和CIK细胞共培养 将培养7 d的经SGC7901细胞裂解液致敏的DC与部分CIK细胞以1∶3的比例混合，以CIK细胞培养液继续培养3 d后收集并计数CIK细胞。另一部分未与DC混合的CIK细胞也收集并计数。在DC及CIK细胞培养的第7天，采用流式细胞仪分析DC细胞表型CD86、CD83，CIK细胞表型CD16+56。
1.2.6 CIK细胞对SGC7901细胞的细胞毒作用及NDV的影响 CIK细胞收集前1 d，消化收集对数生长期的SGC7901细胞，RPMI1640培养液调密度为5×107/L，每孔100 μL加入96孔板，其中部分孔加入50 μL的NDV(1∶160)作用12 h后，收集经抗原、DC作用
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