均值为阳性表达率。
1.3 统计学方法
所获实验数据均以均数±标准差(±s)表示,采用SPSS 12.0统计软件进行单因素方差分析,进行单因素方差分析和显著性检验。预先用Homogeneity of Variances进行方差齐性检验,如方差齐采用LSD检验,如方差不齐采用TamhaaeT2检验,P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 MTT法检测各实验组对COC1/DDP细胞增殖的影响
顺铂、血卟啉、顺铂和血卟啉联用对COC1/DDP细胞增殖的影响两种方法联用的增殖抑制率随着各自浓度的增加而增加,各组与对照组差异有统计学意义(P<0.01)。顺铂和血卟啉联合作用下COC1/DDP细胞的细胞增殖MTT实验OD值表2 顺铂和血卟啉联合作用下COC1/DDP细胞的增殖抑制率
2.2 顺铂和血卟啉联合应用对COC1/DDP细胞凋亡的影响
顺铂组和血卟啉组的凋亡率高于空白对照组,其差异具有统计学意义(P<0.05);血卟啉+顺铂组与血卟啉组和顺铂组相比,其凋亡率高于血卟啉组和顺铂组,其差异均有显著性(P<0.05)。提示血卟啉和顺铂都对COC1/DDP细胞有促进凋亡的作用,而且血卟啉和顺铂联用能够加强这种促进作用。顺铂和血卟啉联合作用下COC1/DDP细胞的凋亡率
2.3 免疫细胞化学检测实验干预后COC1/DDP细胞内bcl2和bax表达的变化
bcl2免疫组化染色光学显微镜下观察到空白对照组和顺铂组中可见许多细胞内胞浆呈棕黄色,高倍镜下可见胞浆内有大量棕黄色颗粒,而血卟啉+超声组和顺铂+血卟啉+超声组此种细胞明显减少。Bax蛋白的免疫组化染色可见在血卟啉+超声组和顺铂+血卟啉+超声组中有较多的胞浆呈棕黄色颗粒的细胞,而对照组和顺铂中的此种细胞较少,bcl2蛋白及bax表达阳性率。统计分析结果表明:血卟啉+超声组和顺铂+血卟啉+超声组的bcl2蛋白阳性表达率显著降低(P<0.05),而空白对照组和顺铂组的细胞内bcl2蛋白阳性表达率差异无显著性(P>0.05)。bax蛋白阳性表达率在各组表达差异无统计学意义(P>0.05)。顺铂和血卟啉联合作用下COC1/DDP细胞的bcl2蛋白及bax表达阳性率
3 讨论
声动力疗法(SDT)是指对肿瘤患者静脉注射声敏剂,而后用一定频率和强度超声辐射肿瘤部位,使聚集在肿瘤部位声敏剂产生抗肿瘤因子而杀伤肿瘤细胞,抑制肿瘤的生长。有学者认为由于超声发生空化作用,其结果是来源于声敏剂的自由基,再与氧分子反应生成过氧基和烷氧基,过氧基和烷氧基与溶液中的有机分子反应活性低,更易于到达靶细胞的表面,破坏癌细胞的脂质和细胞膜,导致膜通透性增强而损伤细胞,此外,过氧基和烷氧基还可以导致癌细胞内蛋白质变性,染色体变异等破坏细胞。目前认为较好的声敏剂仍是卟啉类为主[4],因此本实验选择血卟啉做声敏剂能对超声有良好的敏感性,产生大量活性氧对细胞进行杀伤作用。
本实验发现,COC1/DDP细胞对顺铂明显耐药,血清峰值浓度(2.5 g/ml)以下的顺铂对COC1/DDP细胞增殖未见明显影响,这与文献报道基本一致[5]。但与血卟啉合用时,血清峰值浓度以下的顺铂明显抑制了COC1/DDP细胞增殖。提示超声激活的血卟啉能够提高耐药的卵巢癌细胞COC1/DDP对顺铂的敏感性,从而增加顺铂对该细胞的杀伤作用。干扰细胞周期并诱导凋亡是顺铂治疗肿瘤的重要途径,而血清峰值浓度的顺铂对COC1/DDP的凋亡率几乎无影响,但与血卟啉合用时,可致细胞凋亡率明显升高，这提示超声激活的血卟啉提高耐药细胞株COC1/DDP对顺铂敏感性的机制可能是恢复了耐药细胞株的凋亡途径,从而恢复了顺铂治疗肿瘤的作用。
细胞凋亡是在基因控制下的细胞自身消亡过程,涉及一系列的基因表达的级联反应,受凋亡抑制基因(bc12/bax)和凋亡促进基因的调控。顺铂可以诱导细胞凋亡,但耐药卵巢癌细胞中bc12/bax明显增高,这是导致细胞耐药的重要原因之一。因此,抗肿瘤治疗中,有效地降低bc12/bax含量是取得疗效的关键之一。
已有研究发现,提高细胞内活性氧的水平,细胞凋亡的发生率明显增加,认为细胞内的ROS作为一种信使分子在调控细胞生存及凋亡过程中起关键作用[6,7]。1988年,Vaux等[8] 首先证实bcl2基因高表达可明显延长细胞的生存周期。体外研究亦表明bcl2可阻止许多刺激物诱发的细胞凋亡,且bcl2的抑制可能是细胞凋亡的共同通道[9]。
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