化疗疗效和生存质量。化疗耐药是多因素、多途径共同作用的结果,抗癌药物诱导细胞凋亡受阻是其重要机制之一。因此,寻找一种新兴治疗理念逆转耐药或者直接灭活耐药卵巢癌细胞是医学工作者亟待解决的关键问题,更是肿瘤康复中提高女性生产率和改善女性生活质量的迫切需要。声动力疗法(SDT)是一种很有应用前景的治疗肿瘤的方法。大量研究表明,超声加血卟啉(hematoporphyrin,Hp)比单独超声对肿瘤细胞更具有杀伤效果,血卟啉则无抗肿瘤效应[1,2]。有报道说这种杀伤作用机制是通过诱导细胞凋亡[3]。在本实验中,作者把超声激活的血卟啉联合顺铂作用于人卵巢癌顺铂耐药细胞,观察其杀伤的作用,以期降低卵巢癌对顺铂化疗的耐药。
1 材料、仪器与方法
1.1 材料
1.1.1 试剂和仪器 超声增敏剂血卟啉购自Sigma公司,注射用顺铂购自齐鲁制药有限公司(国药准字H37021358),四甲基偶氮唑蓝(MTT)、姆萨色素为Sigma公司。血卟啉和MTT均以生理盐水配成5 mg/ml的溶液,过滤除菌后4 ℃避光保存。超声装置为陕西师范大学声学研究所研制,探头面积为4.7 cm2.
1.1.2 细胞系及培养 肿瘤细胞株为人卵巢癌顺铂耐药细胞株COC1/DDP(购自中科院上海细胞生物学研究所)。COC1/DDP在含有0.5 μg/ml顺铂的完全培养基(50 μg/ml青霉素,50 μg/ml链霉素和10 %胎牛血清的RPMI 1640细胞培养基)37 ℃,5 % CO2常规细胞培养、传代。实验前1周换用不含顺铂的完全培养基培养。
1.2 方法
1.2.1 MTT法检测各实验组对COC1/DDP细胞增殖的影响 把细胞制成单细胞悬液,以每孔0.2×104个接种于96孔板中,每孔200 μl完全培养基。12 h后进行实验干预,按以下分组进行实验干预,A组(对照组):单纯培养COC1/DDP细胞;B组(单纯顺铂组):在细胞中加入顺铂,顺铂选0.625、1.25、2.5、5 μg/ml 4个浓度;C组(血卟啉+超声组):血卟啉选0.012 5、0.025、0.05、0.1 mg/ml 4个浓度,同时进行超声照射60 s;D组(顺铂+血卟啉+超声组):细胞液中加入顺铂和血卟啉,使其终浓度分别为0.625、1.25、2.5、5 μg/ml和0.012 5、0.025、0.05、0.1 mg/ml,同时进行超声照射60 s.每组设5个复孔,此时记为0 d;于37℃、5 % CO2的饱和湿度箱中继续培养和观察,于3 d后取出 96孔板,1 200 r/min离心10 min.去上清,加入180 μl完全培养基和20 μl MTT,37 ℃继续培养4 h,离心后小心吸弃上清。再加入150 μl DMSO,振荡10 min,充分溶解。选择490 nm,在酶标仪测定各孔吸光率。实验重复3次。按下列公式求出增殖抑制率:肿瘤细胞增殖抑制率=[1(药物处理组OD值空白对照组OD值)/(细胞对照组OD值空白对照组OD值)]×100 %.
1.2.2 PI/Hoechst染色检测细胞凋亡情况 细胞生长达80 %融合时消化传代,以每孔0.3×104个接种于96孔板中,每孔200 μl完全培养基。12 h后进行实验干预,分组同前,72 h后,每孔依次加入细胞染色缓冲液100 μl、Hoechst染色液0.5 μl、PI染色液0.5 μl冰浴30 min,PBS洗涤1次,再在荧光显微镜下观察。计数凋亡细胞比例。
1.2.3 免疫细胞化学检测实验干预后COC1/DDP细胞内bcl2和bax表达的变化 选取对数生长期的COC1/DDP细胞,制成单细胞悬液,按2×104/ml接种于24孔培养板,继续培养12 h后按前述方法进行分组处理。各组细胞经实验处理后置于37 ℃,5 % CO2孵箱中继续培养8 h,收集细胞,涂布细胞于经多聚赖氨酸处理过的载玻片上,室温风干,纯丙酮室温固定30 min.按免疫组化试剂盒使用说明书分别进行:纯甲醇加过氧化氢至0.5 %,室温30 min以灭活内源性过氧化物酶,蒸馏水洗涤后，滴加免抗bcl2(或bax)基因抗原的抗体,置湿盒中37℃,20 min,0.01 N PBS洗2 min×3次后，滴加生物素化羊抗兔IgG,置湿盒中37℃,20 min.0.01 N PBS洗2 min×3次后滴加SABC 37 ℃,20 min,0.01 N PBS洗5 min×4次后，DAB显色10 min,蒸馏水洗涤，苏木素轻度复染、脱水、透明、封片。光学显微镜下观察细胞浆着色呈棕黄色的为阳性细胞,每张片随机计数3个视野,每样品取5张片的平
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