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外源性Rb基因对卵巢癌细胞株生长的抑制作用 |
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构建Rb cDNA片段的生长缺陷型重组腺病毒载体。即将含有Rb cDNA 的片段插入腺病毒质粒载体pXCJL-1的 BamH 1位点，转入人胚肾细胞株，筛选扩增阳性克隆，收集纯化并测定病毒滴度。以同样方法构建LacZ基因重组腺病毒载体，作为对照。
二、卵巢癌细胞株CAOV3的培养
将卵巢癌细胞株CAOV3(美国肿瘤研究所提供）置于含15%胎牛血清的L15培养基，于37℃，5%二氧化碳条件下培养。
三、外源性Rb基因体外转染及表达的检测
1. LacZ基因表达的检测：将细胞株CAOV3接种到有盖玻片（2 cm×2 cm)的6孔培养板中，24 h后换液（细胞达80%汇合），加入含LacZ基因的病毒，继续培养 48 h，以x-gal染色LacZ基因表达的β半乳糖（β-gal），从而检测腺病毒作为基因载体的转染率。
2.细胞株CAOV3内Rb蛋白的检测：将细胞株CAOV3接种到6孔培养板中，加入不同滴度含Rb基因的病毒，培养48 h，采用免疫组织化学法检测 Rb蛋白（抗Rb单克隆抗体由美国Triton Bioscience公司提供)。苏木素染色，细胞核呈棕色为 Rb蛋白阳性表达，光镜下摄片（×400倍)。
3.外源性Rb cDNA的检测：(1)细胞DNA的提取：收集已转染及未转染Rb基因的CAOV3细胞，常规破膜，加入提取液， 50℃消化过夜，用酚、氯仿、异戊醇（比例为25∶24∶1）抽提DNA，乙醇沉淀，三羟甲基氨基甲烷-乙酸缓冲液溶解DNA。(2)聚合酶链反应(PCR)扩增Rb cDNA：采用特异Rb cDNA第7个外显子核苷酸序列引物，经94℃ 1 min，50℃ 30 s，72℃ 1 min, 共30个循环。反应体积为30 μl。(3)琼脂糖电泳：取10 μg PCR产物，经1.4%的琼脂糖电泳，行溴乙锭染色分析。
四、外源性 Rb基因作用下CAOV3细胞生长的检测
1.细胞生长曲线：CAOV3细胞接种于24孔培养板中， 24 h后换培养液，加入含Rb基因的病毒继续培养。分别于24、 48、 96 h，经0.5%萘酚蓝黑染色，于波长570 nm测定吸光度(A)值，计算每样本 6孔的平均值［5］。对照组包括不加含Rb基因病毒者及加腺病毒β-gal者。
2.四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测：CAOV3细胞接种于96孔培养板中，接种 24 h后加入含 Rb基因的病毒，继续培养72 h。未转染病毒及转染LacZ基因病毒者为对照组。应用MTT试剂盒（德国Boehringer公司产品），按说明书操作，于波长570 nm检测A值。
3.流式细胞仪分析细胞生长周期：收集Rb基因、LacZ基因转染72 h的细胞及未转染病毒的细胞，以70%乙醇固定后加入1 ml 磷酸缓冲液(PBS)及RNA 酶(10 mg/ml)5 μl，37℃下水浴30 min，4℃下经碘化乙丙锭避光染色30 min。采用流式细胞仪检测细胞生长周期。
结果
一、重组腺病毒载体对CAOV3细胞的转染及外源性 Rb基因的表达
1.转染率： LacZ基因重组腺病毒载体转染CAOV3细胞后 24 h，经β-gal染色，90%为阳性，表明重组腺病毒载体可以有效转染CAOV3细胞。含 Rb基因的腺病毒体外转染CAOV3细胞48 h，80%细胞中有Rb蛋白表达，而未转染腺病毒的CAOV3细胞中无 Rb蛋白的表达。见图1。
图1 转染CAOV3细胞内Rb蛋白的表达．β－gal染色×400
2. Rb cDNA检测：转染Rb基因的CAOV3细胞提取的DNA，经 PCR扩增，琼脂糖电泳检测出Rb cDNA条带，与含Rb cDNA质粒电泳条带位置一致，见图2。而对照组CAOV3细胞中未检测出Rb cDNA条带。
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