骨形态发生蛋白 对人始基卵泡的作用

　　1.4 雌孕激素测定

　　用德国拜耳公司ACS：180自动化学免疫发光仪测定培养后培养液雌孕激素浓度。

　　1.5 原位末端标记(TUNEL)分析

　　培养结束后对照组和BMP-4组标本进行TUNEL分析(试剂盒为 In Situ Cell Death Detection Kit-AP，购自德国Roche公司)，按照试剂盒说明书进行操作。细胞核内出现明显的弥散性或颗粒性深蓝染色为凋亡阳性细胞，卵母细胞内或/和 ≥ 50%颗粒细胞出现阳性TUNEL染色为凋亡卵泡[5]，10个高倍视野下( × 400)计数卵泡和间质细胞凋亡阳性细胞数，按如下公式计算卵泡凋亡指数(apoptotic index of follicle， AIF)和间质细胞凋亡指数(apoptotic index of interstitial cell，AII)[6]：卵泡凋亡指数(AIF) = 凋亡卵泡数/总卵泡数 × 100;间质细胞凋亡指数(AII) = 凋亡间质细胞数/总间质细胞数 × 100。

　　1.6 统计处理方法

　　用SPSS 11.0统计软件包进行统计分析。数据采用(x ± s)表示，3组之间每高倍镜视野下卵泡数、始基卵泡和窦前卵泡所占比例、对照组和BMP-4组AIF和AII以及雌孕激素浓度的不同用随机区组化方差分析(randomized complete-block ANOVA)进行统计分析，各组之间两两比较用Tukey HSD法，P < 0.05认为有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 BMP-4对卵泡生长发育的影响

　　非培养组、对照组和研究组每高倍镜视野卵泡数无明显差异(F = 0.634，P > 0.05);研究组始基卵泡比例低于对照组(F = 9.8171)，窦前卵泡比例高于对照组(F = 9.718)，无统计学差异，P > 0.05;研究组和对照组始基卵泡比例明显低于非培养组(F值分别为43.1005和33.3824)，窦前卵泡比例明显高于非培养组(F值分别为43.100和33.382)，均有统计学差异(P < 0.05;表1，图1，2)。

　　2.2 BMP-4对基础雌孕激素分泌的影响

　　培养结束后培养液雌二醇浓度研究组低于对照组，无统计学差异，P > 0.05;孕激素浓度研究组显著低于对照组(P < 0.05;表2)。

　　2.3 BMP-4对卵泡和间质细胞存活的影响

　　TUNEL分析中对照组和研究组均未发现卵泡凋亡，研究组间质细胞凋亡指数为0.16 ± 0.08，显著低于对照组的0.41 ± 0.16 (F = 13.113，P < 0.05)。

　　3 讨 论

　　骨形态发生蛋白是转移生长因子-β (transform-ing growth factor-β， TGF-β)超家族中最大的一个家族，是卵巢内调节系统的重要组成成员，其中BMP-4在哺乳动物卵巢中的功能也有实验报道[7]，目前认为BMP-4在卵巢组织内通过局部信号传导系统调节卵泡的生长发育、存活以及雌孕激素分泌。

　　3.1 BMP-4对卵泡生长发育的影响

　　本研究显示，人卵巢组织皮质片在体外培养过程中加入BMP-4后始基卵泡比例明显下降，而窦前卵泡比例明显升高，与Nilsson等的动物实验结论相一致[3]，说明BMP-4可能具有促进体外培养过程中人始基卵泡向窦前卵泡转化以及生长发育的作用，是调节人原始-窦前卵泡转化和早期卵泡生长的促进因子。虽然与非培养组相比，对照组培养结束后始基卵泡的比例也是下降的，窦前卵泡的比例也是升高的，但变化幅度不及BMP-4组明显，如能适当延长体外培养时间，BMP-4将可能充分发挥其促进始基卵泡体外转化和生长的作用，这将为实现人类从始基卵泡培养到可供移植胚胎的完全体外操作提供更多机会。

　　3.2 BMP-4对卵泡雌孕激素基础分泌的影响

　　动物实验表明BMP-4可以在提高FSH诱导颗粒细胞分泌雌二醇的同时抑制孕激素的分泌，并能降低在没有FSH诱导情况下的孕激素分泌，即孕激素的基础分泌[3，8]，而且与激活素(activin)、促性腺激素释放激素(gonadotropin-releasing hormone，GnRH)相互作用调节促性腺激素(gonadotropin，Gn)的分泌[9]。本研究显示，与对照组相比，BMP-4组

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