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卵巢癌抗独特型抗体6B11scFv和人粒细胞 |
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中心构建，含6B11scFvcDNA［4］；质粒PBV221-GM-CSF由中国科学院微生物所丘并生研究员提供，内含hGM-CSF cDNA；表达载体pKpL-3a及大肠杆菌pop2136由北京医科大学马大龙教授提供；质粒pUC18购自北京华美生物制品公司。
二、限制性内切酶和工具酶
内切酶NcoⅠ、 XbaⅠ、 BglⅡ为中国医学科学院基础所产品；SpeⅠ、 BamHⅠ、 ApaⅠ及工具酶T4 DNA Ligase、 Taq DNA Polymerase、 Klenow 均为美国Promega公司产品；T7测序盒为瑞典Pharmacia公司产品。
三、连接肽DNA和引物
连接肽DNA和引物均由美国赛百盛公司合成。连接肽DNA编码13个氨基酸，为甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸的重复序列。6B11scFv的上游引物为：5′-CGCCATGGGACAGGTCAAACTGCAGGAGTC-3′，下游引物为5′-CGGGATCCCCGTTTTTATTTCCAACTTT- GTCC-3′，扩增片段760bp；GM-CSF上游引物为：5′ -GCACTAGTGCACCGGCCCGCTCTCTCCGAG-3′，下游引物为：5′-GCTCTAGATCACTCCCTGGACTGGCTCCC-3′,扩增的片段约为380 bp。
四、抗体
COC166-9单克隆抗体(单抗)，为妇科肿瘤中心制备，是6B11的初始抗体。小鼠抗人hGM-CSF单抗，辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG购自军事医学科学院。
五、6B11scFv和hGM-CSF融合蛋白表达载体的构建
1．聚合酶链反应(PCR)扩增6B11scFv和hGM-CSF cDNA片段：PCR反应条件均为变性94℃30秒，退火60℃30秒，延伸72℃90秒，扩增30次循环。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，玻璃乳回收，并用 Klenow酶修平。
2．表达载体的构建：先对载体进行改造，插入连接肽序列和酶切位点NcoⅠ、 BamHⅠ、 SpeⅠ、XbaⅠ，改建的载体命名为pKPL-r。再分别在连接肽序列的两端插入6B11scFv(NcoⅠ与BamHⅠ之间)和hGM-CSF(SpeⅠ与XbaⅠ之间)PCR扩增片断。表达载体命名为pL6B11GM。应用基因内部和载体上的酶切点对表达载体进行鉴定。将融合基因克隆到pUC18，按T7测序盒的说明进行序列测定。
六、诱导表达
重组表达载体转入大肠杆菌pop2136，选取单菌落。用温度变化进行诱导表达，42℃诱导4小时后，取1 ml菌液，高速短暂离心。沉淀物进行10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)考马斯亮蓝染色，观察新增加的条带及表达量。
七、蛋白免疫印迹分析
上述样品经SDS-PAGE电泳后，在Bio-Rad转膜仪上转至硝酸纤维素膜。一抗分别加COC166-9和小鼠抗人hGM-CSF单抗，二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG，以DAB显色。
结果
一、PCR扩增6B11scFv和hGM-CSF
PCR经30次循环后，扩增产物1％琼脂凝胶电泳，在760 bp和380 bp处可见特异扩增条带，符合 6B11scFv和hGM-CSF的cDNA长度(图1,2)。
1：Phi 174/Hae Ⅱ标记
2： 6B11scFv PCR产物
3： 阴性对照
图1 6B11scFv PCR扩增产物电泳图
1、2、4、5：hGM-CSF PCR产物 3：Phi 174/Hae Ⅱ 标记 6：阴性对照
图2 hGM-CSF PCR扩增产物电泳图
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