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孕妇血中富集胎儿细胞技术的进展 |
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周郅隆
绒毛活检和羊水细胞核型分析，是目前主要的产前诊断方法，因其为侵入性的检测技术，对母儿存在着一定程度的损伤及并发症。为此，近年来许多学者应用超声检测、母血标记物和从脐血中抽取胎儿细胞来提高产前诊断的正确性和扩大其应用范围，但仍受到技术操作和诊断困难的限制。分子生物学的发展，使人们可以从母血中分离出胎儿细胞，并进行核型分析和基因诊断。该方法为非侵入性，对母儿无任何损伤或并发症，且有一定的确诊率，现简述如下。
一、胎儿细胞富集发展史
1996年Walknowska等［1］首先在妊娠男性胎儿的孕妇血中分离出胎儿细胞，并找到“XY”有丝分裂中期细胞。1971年De Grouchy等［2］同样也找到“XY”有丝分裂中期细胞。 Herzenberg等［3］在1979～1981年间连续数次应用流量拣选法（flow-sorting techniques）富集到人白细胞A抗原(HLA-A2)淋巴细胞，该抗原在母系中不存在，而只存在于父系中。因而，HLA-A2淋巴细胞来自胎儿。伴随着聚合酶链反应(PCR)技术的问世，又提出了应用PCR来证实母血中存在胎儿细胞的方法。1989年Lo等［4，5］成功地放大了1个Y-序贯，证明妊娠男性胎儿的孕妇通过上述检测，显示杂交后的Y-特异性信号的可能绝对超过妊娠女性胎儿孕妇。
二、富集的胎儿细胞种类
1.滋养细胞（trophoblasts）：滋养细胞与子宫的关系最紧密。当他们侵入子宫内膜时，很可能有若干滋养细胞进入母血循环。Covone等［6］应用抗H315单克隆抗体，在不同孕期中均能从母亲末梢循环中分离出滋养细胞。接着，许多学者又从胎盘中分离出了6 000种抗滋养细胞单克隆抗体，用于从母血中分离胎儿细胞。Mueller等［7］认为，其中有5种对胎儿细胞有特异性，他们作了PCR扩增证实有Y-序贯存在。Bruch等［8］应用代号为GB17、GB21、GB25的单克隆抗体对合体滋养细胞进行分离。另外，应用GB25单克隆抗体同时对合体滋养细胞和细胞滋养细胞进行分离,发现并无特异性。Cacheux等［9］应用免疫磁性淋巴细胞去除法和流量拣选法分离出胎儿细胞，并进行荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH），检出47XYY细胞，在1 387个细胞核中，只有14个（1％）显示2个Y-特异性区域（domain），而45个（3.24%）则显示1个Y-特异性区域。
2. 淋巴细胞(lymphocyte)：Herzenberg等［3］应用Ficoll-Hypaque密度位差离心法，从母血中分离出胎儿白细胞，通过荧光激活细胞拣选法（fluorescence-activated cell sorting， FACS）检测分离出的白细胞是否为HLA-A2阳性，因为父系是HLA-A2阳性，而母系则为阴性，再行染色，找寻Y-染色质。Simpson等［10］从男性胎儿或非整倍体胎儿的母系中分离出的中期细胞都是46XX，说明存在着的是胎儿淋巴细胞，且对裂变物无反应。因前次妊娠留下的淋巴细胞可持续存在于母体中［11］此法现已摒弃不用。
3. 颗粒白细胞（granulocytes）：Wess- man等［12］应用Ficoll-Paque密度位差离心法，分离出胎儿细胞，再用FISH及Y-特异探针，找出多种染色质（heteroc- hromatic）的Yq，但未进行胎儿细胞富集即获得如此多量的胎儿颗粒白细胞，无法给以圆满解说，因而不可靠。
4. 有核红细胞（nucleated red blood cell，NRBC)：孕11周时，在胎儿循环中NRBC占红细胞总数的10％［10］，孕19周时为0.5％，成人中NRBC极为罕见。因而，母体中如发现NRBC必来自胎儿。在脐血及新生儿血液中，NRBC为分裂最快的细胞，且胎儿红细胞可存活90天，远比成人红细胞只存活30天为长［13］，因而，可以选择NRBC作为分离的胎儿细胞。
Bianchi等［14］首先应用转铁蛋白受体(transferrin receptor，CD71）阳性的流量拣选法，分离出胎儿NRBC，以PCR显示出Y-序贯的8例中，6例为妊娠男性胎儿的孕妇血标本。血型糖蛋白A(GPA)为造血红细胞膜中主要涎腺糖蛋白，它存在于红细胞系，不存在于白细胞系。故如与CD71和GPA抗体均结合者，很可能是早期的红细胞，即胎儿红细胞。
Durrant等［15］应用对细胞滋养细胞和合体滋养细胞[1] [2] 下一页
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