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急性脑缺血大鼠边缘系统谷氨酸及其受体对下丘脑 |
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GluR was typically up-regulated. The CRHmRNA expressive levels were markedly enhanced in the tempol cortex, the hippocampus and the hypothalamus atI1h,and kept to IR96h,the ACTH concentration in the plasma increased relatively. In the peak time of reperfusion,the Glu content of hypothalamus was positively corrected with CRHmRNA expressive positive cell amounts of the hypothalamus. Conclusion CRH may aggravate ischemic neuronal damage, and Glu participates in the pathogenesis of HPA axis be excited strongly and may be an important impel factor for ACI specially condition.
【Key words】 Cerebral ischemia Amino acid Receptor Hypothalamus-pituitary-adrenal axis
(Natl Med J China, 1998, 78：547-550)
急性脑缺血(ACI)时神经元过量释放的谷氨酸(Glu)对缺血神经元损伤起关键作用［1］。下丘脑广泛分布有Glu及其受体(GluR)，生理条件下对下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴等有重要调节作用［2，3］，但病理状态特别是急性脑缺血(ACI)特定应激条件下，有关边缘系统、下丘脑Glu、GluR对中枢神经系统应变调控的影响及机制的研究鲜见报道。 为此，作者对不同时相缺血海马和下丘脑的Glu含量，GluR容量及其离解常数(kd)进行了测定，并同步监测了脑内促皮质释放激素(CRH)信使核糖核酸(mRNA)表达水平和血浆促肾上腺皮质激素(ACTH) 的变化，拟探讨ACI边缘系统Glu、GluR对CNS应变调控的影响及机制。
材料与方法
一、材料
1.动物分组：Wistar大鼠120只，由本校野战外科研究所动物室提供，雌雄不拘，体重253±38 g。随机分为对照组(40只)和大脑中动脉缺血/再灌流组(简称ACI组，40只)。每组观测8个时相点，分别为缺血前，缺血15、30分钟、1小时，缺血1小时再灌流3、24、48及96小时。每个时相点Glu和GluR检测各用5只大鼠。原位杂交设缺血前、缺血1小时、再灌流24h和再灌流96小时4个时相点(40只)。
2.大鼠MCA缺血／再灌流模型按照Koizumi等［4］的方法复制。
二、方法
1.Glu含量测定：冰盘上切取下丘脑、海马各约60～120 mg，称重后用10%磺基水杨酸钠溶液2ml冰浴匀浆，1 000 g，离心15分钟将上清液定容为2 ml，HPLC分析系统检测,磷苯二甲醛等柱前演生，柱长26 cm，柱温37℃，流动相为30％甲醇/磷酸缓冲液。
2.GluR最大结合容量及Kd值测定：参照Meeker等［5］方法进行。谷氨酸标准品为美国Sigma公司产品，3 H-谷氨酸由上海原子核研究所标记。
3.ACTH浓度：采用放射免疫分析(RIA)法检测。ACTH放射免疫检测药盒为美国DPC公司产品。
4.CRHmRNA原位杂交及定量图象分析：动物届时用0.5%戊巴比妥钠(30 mg/kg，皮下注射) 麻醉后，用4℃多聚甲醛150 ml主动脉灌注,取出全脑，置于4%多聚甲醛溶液后固定4～6小时，转入30%蔗糖多聚甲醛脱水过液。经下丘脑中央部行全脑冠状连续冰冻切片(部分为缺血大脑连续矢状切片)10张(厚20 μm)。采用漂洗法原位杂交( CRH-cRNA探针由本校组胚教研室提供)。阴性对照以20 μl/ml RNA酶A(37℃)处理切片30分钟，同法操作。每个阳性杂交部位在100倍光镜下随机选取3 个视野进行定量图象分析，测出单位平方毫米的晶体数，然后运算出每平方毫米脑组织切片的阳性杂交细胞数,再求出3个视野的平均数。
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