延胡索中紫堇碱标准品的制备及含量测定

　　2  方法与结果

　　2.1  紫堇碱粗提物的制备  延胡索块茎粗粉5 kg，用30倍量的70％乙醇40 ℃超声提取1 h，滤过，滤液减压回收溶剂，得乙醇提取浸膏。乙醇提取浸膏加入1％的盐酸溶液溶解，滤过。滤液用浓氨水调pH 9~10，用乙醚反复萃取，合并萃取液，减压低温回收溶剂，得紫堇碱粗提物。

　　2.2  色谱条件

　　2.2.1  制备的HPLC色谱条件  XTerra Prep RP-18柱（10 μm ,150 mm × 7.8 mm）；柱温为室温；检测波长280 nm；流动相为甲醇-0.03 mol/L的磷酸二氢钠(61∶39)；流速3.00 ml/min。

　　2.2.2  分析的HPLC色谱条件  DiamonsilTM C18柱 (5 μm, 250 mm× 4.6 mm)，柱温30 ℃；检测波长280 nm，流动相为0.10 ％ 的磷酸(三乙胺调pH = 6.0) -乙睛(48∶52)，流速1.00 ml/min。

　　2.2.3  紫堇碱对照品的制备纯化  取紫堇碱粗提物1.0 g，用10 ml甲醇超声溶解，过0.45 μm滤膜，备用。吸取1.0 ml样品进半制备型高效液相色谱仪，收集保留时间所在的组分，减压回收溶剂，得紫堇碱粉末。加乙醇适量溶解，重结晶，即得。

　　2.3  纯度分析

　　2.3.1  薄层色谱分析  薄层板：高效薄层层析板(GF254)。3种展开剂系统：正丁醇-乙酸-水（10∶1∶0.5）；醋酸乙酯-氯仿-甲醇-二乙胺(8∶2∶2∶1)；乙醚-环己烷-甲醇（5∶3∶0.5）。点样：在同一板上，按20，40，60，80，100 μl不同的浓度点样。展距8 cm，定位后经紫外254 nm、碘蒸气及碘化铋钾溶液显色检视。结果在薄层色谱同一位置处，均为单一斑点，未见杂质斑点，符合化学品要求。

　　2.3.2  紫外检测  取紫堇碱对照品乙醇溶液经紫外光谱扫描，结果表明最大吸收波长为280 nm，因此，确定280 nm为测定波长。

　　2.3.3  面积归一化法  精密称取紫堇碱对照品，用流动相制成浓度为0.13 mg·ml-1的样品溶液，按照“分析HPLC色谱条件”，进样10 μl，样品显示为单峰，用面积归一化法计算含量为99.5％（保留时间为12.15 min），符合中药化学对照品含量测定用要求。结果见图1。

　　2.4   结构鉴定  紫堇碱为无色棱状柱晶（乙醇），熔点135℃。1H NMR (400MHz, CDCl3) δ: 0.95 (3H, d, J = 6.8 Hz, CH3), 2.60 (2H, m, 5-H), 3.10 (2H, m, 6-H), 3.22 (1H, m, 13-H), 3.50 (1H, d, J = 16.0 Hz, H-8α), 3.69 (1H, s, 14-H), 3.87 (12H, m, 4-OCH3), 4.20 (1H, d, J = 16.0 Hz, 8-Hβ), 6.61 (1H, s, 4-H), 6.69 (1H, s, 1-H), 6.82 (1H, d, J = 8.4 Hz, 11-H), 6.91 (1H, d, J = 8.4 Hz, 12-H). 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ: 18.3 (-CH3), 29.2 (C-5), 38.2 (C-13), 51.3 (C-6), 54.4 (C-8), 55.7 (OCH3), 55.8 (OCH3), 56.0 (OCH3), 60.0 (OCH3), 62.9 (C-14), 108.5 (C-1), 110.8 (C-

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