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骨痂组织冰冻切片前胶原及转化生长因子－β1基因表达的原位定位 |
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ondrocytes were found scattering in the woven bone and remains of cartilaginous callus.The levels of TGF－β1 mRNA in positive cells were very low.Conclusion TGF－β1 played an important role in fracture healing.The phenomenon of shared phenotype expression in developing tissues may provide an important approach to reveal the mechanism of the origin,differentiation,and orientation of cells.The method applied in this study was an easier,quicker,more sensitive and with high specificity.
【Key words】Callus Frozen sections In situ hybridization Transforming growth factor betaGeneexpression
原位杂交(in situ hybridization,ISH)是一种有效的分子生物学检测技术，尤其是非同位素标记的原位杂交技术，以其更清晰的空间分辨率、无辐射危害、经济和简捷方便而倍受青睐，被广泛应用于实验和临床，以研究细胞组织的发生、分化和演变，分析中期和间期染色体以及检测病毒感染。然而，该技术在骨科方面的应用则起步较晚，部分由于骨组织比较特殊，制片前，一般都需脱钙，而较长时间的脱钙可能会使mRNA有所降解，影响检测结果。有鉴于此，作者对此技术稍作改进，采用不脱钙的骨痂组织冰冻切片进行原位杂交，并与先前的有关文献作对照，在验证前人研究结果的同时，希望总结出一种更快捷、灵敏、却不失特异性的骨组织的原位杂交方法。同时，了解骨折愈合过程中前胶原和转化生长因子－β1(transforming growth factor β1,TGF－β1)基因的表达，也有助于从分子水平认识TGF－β1在骨折愈合过程中的作用，为从分子水平干预骨折愈合以及了解组织细胞起源、分化和转归等提供参考。
材料与方法
一、动物模型与组织切片的制作
健康成年Wistar大鼠6只，做双侧桡骨骨折模型[1]。术后1、2、4周后处死，取材，每次2只，骨痂组织取下后，DEPC水配制的磷酸缓冲液(PBS)冲去血迹，迅速置液氮内冻存。然后，在冰冻切片机上，做6μm厚的连续冰冻切片，置预先硅化的涂有多聚赖氨酸的载玻片上，质量分数为4％的多聚甲醛(含0.1mol/L蔗糖的质量浓度0.1mol/L的PBS，pH7.2，配制)室温下固定15分钟，PBS洗2次，各10分钟。质量浓度为0.2mol/L的HCl室温下作用10分钟，质量分数为0.1％TritonX－100作用15分钟，含质量分数为0.2％甘氨酸的PBS室温下孵育10分钟，蛋白酶K消化15分钟，含质量分数为0.2％甘氨酸的PBS室温下再孵育10分钟，PBS－5mmol/LMgCl2洗2次，各15分钟，逐级酒精脱水，空气干燥。
二、探针的制备
有关前胶原基因cDNA探针的质粒[pHCAL1(Ⅰ型)，pHCAR1和pHCAR3(Ⅱ型)，pHFS3(Ⅲ型)]，均由芬兰Turku大学惠赠，合成方法参照有关文献[2]。TGF－β1寡核苷酸探针的探针序列：CTTGCTGTACTGTGTGTCCAA，由DNA合成仪合成。标记采用Boehringer Mannheim公司Dig标记试剂盒，方法参照试剂盒所附说明。
三、原位杂交
采用非同位素Dig标记原位杂交，杂交及显色检测均采用Boehringer Mannheim公司Dig标记检测试剂盒，方法参照试剂盒所附说明及有关文献[2－5]。
测试对照设立：(1)杂交液中不加标记探针；(2)杂交前以RNase处理切片。
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