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大黄对烫伤后肝脏内肿瘤坏死因子基因表达的影响 |
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of the portal and femoral blood increased. Rhubarb could reduce the endotoxin level in both blood. Conclusions Rhubarb can inhibit scald and gene expression of TNF－α in liver following the second hit and promote the clearance of endotoxin.
Key words：Burns； Tumor necrosis factors； Endotoxins; Liver; Rhubarb▲
肠-肝-肺轴对创伤后系统炎症反应的转归有重要作用。严重创伤后，肠黏膜屏障破坏，肠道内细菌和毒素经门静脉和淋巴引流侵入肝、肺，肝脏内枯否细胞激活，创伤反应首先在肝脏内被“扩增”；富含细胞因子和炎性介质的肝静脉血回流至肺，加之肺还接受胃肠道的淋巴引流，肺组织内巨噬细胞被激活，积极参与系统炎症反应，来自肝、肠的创伤反应的“信息”进一步被肺“放大”，肺又反馈于肝、肠，形成恶性循环，最终导致多器官功能不全综合征（MODS）。如果创伤反应是局部、自限性的，肠-肝-肺轴的作用是缓冲创伤反应；反之，则倍增创伤所致的系统炎症反应。杨建东等［1］和笔者［2］过去的工作证明中药大黄能保护肠黏膜屏障，抑制炎症反应，但其药理作用机制尚未完全阐明。笔者旨在研究大黄对肝脏内细胞因子基因表达的影响，揭示大黄“清热解毒”的药理机制。
材料与方法
1. 模型制作：雄性SD大鼠（上海西普尔-必凯实验动物中心提供）220～250 g，氯胺酮腹腔内注射麻醉（80 mg/kg），背部脱毛，右侧股静脉插管。烫伤模型根据Mason方法改良而成。大鼠固定于烫伤架上，将背部浸泡于沸水12 s，烫伤面积为25%，深度为Ⅲ度。大鼠即用平衡盐液按100 ml/kg由股静脉输注复苏，烫伤后24 h收集标本。
2. 实验设计：动物随机分为烫伤组，烫伤加内毒素组，治疗组和对照组。烫伤组大鼠仅给予背部25%面积的Ⅲ度烫伤；烫伤加内毒素组大鼠于烫伤后12 h经静脉持续输注内毒素，剂量为20 mg/kg；治疗组大鼠在烫伤和后继内毒素“二次打击”的基础上给予精制大黄片(上海香山中医医院大黄研究室研制，上海中药制药一厂生产，1 g精制大黄片相当于生药4 g)治疗，将大黄片按50 mg/kg 的剂量研成粉后溶于1 ml等渗盐水经胃管灌入，预实验证明大黄50 mg/kg在其最佳剂量范围；对照组除不予以烫伤外，其他处理同烫伤组。烫伤组、烫伤加内毒素组和对照组经胃管给予等量等渗盐水替代大黄治疗。
3. 标本收集：烫伤后24 h经股静脉采血2 ml，剖腹经门静脉采血2 ml，4 000 ×g离心10 min，血浆储存于-70℃冰箱待测。从肝右叶切取肝组织3 g，储存于液氮待测。
4. RNA分离：总RNA分离应用德国QIAGEN公司Rneasy mini kit试剂盒。RNA浓度测定应用紫外分光光度计（Shimadzu UV-160，Japan），质量根据A260/A280比值（>1.8）及应用质量浓度为10 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定。
5. RT-PCR方法：RNA逆转录和cDNA扩增：根据Sambrook手册改良而成［3］。TNF-α引物序列：上游为5’-GCACAGAAAGCATGATCCGCG-3’，下游为5’-AGTTCTCGGGAACGGGATTCCTGTG-3’（535 bps）。内参照β-Actin引物序列：上游为5’-GAGCACCCTGTGCTGCTCACCCTAGG-3’，下游为5’-TCGCACCGATGTCGAAGTGGTGGTG-3’（310 bps）。 PCR条件：94℃预变性5 min，循环：94℃ 2 min，50℃ 2 min，72℃ 2 min，35个循环。预实验证明35个循环在PCR反应的线性扩增范围内。PCR产物应用质量浓度为20 g/L琼脂糖凝胶电泳分离，扫描仪（EPSON GT-5500 WINS）扫描电泳条带，测定PCR产物和内参照吸光度比。
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