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苹果果肉质膜微囊主动运输Ca2 的Ca2 |
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合在质膜上依赖于钙调蛋白的ATP酶而完成(Zocchi和Hanson 1983，Askerlund 1996)；次级主动运输则是由液泡膜上的H+-ATP酶作为质子泵，使液泡内H+积累，液泡内的H+可与胞质Ca2+逆向运输，从而维持胞内的低Ca2+浓度（Schumaker和Sze 1985，Blumwald 1986）。有研究发现，甜菜贮藏组织内质网膜上存在依赖于Mg-ATP和Ca2+的主动运输Ca2+的ATP酶(即Ca2+-ATP酶), 它受Ca2+ 载体A23187刺激而活性增加(John等 1987)；萝卜幼苗质膜微囊上亦存在着依赖于Ca2+的运输系统(Rasi-Caldgno等1989，1992)；质膜微囊Ca2+-ATP酶特性因供试材料不同而差别很大（Williams等1990，Rasi-Caldgno 等1992）。而有关苹果果肉质膜微囊Ca2+-ATP酶与Ca2+运输的关系尚未见报告, 亚细胞水平外源激素如生长素、萘乙酸和赤霉素等对该酶活性及Ca2+运转的影响很不明确。
本实验以苹果幼果为试材，在对果肉细胞膜微囊Ca2+-ATP酶定位的基础上，着重研究质膜微囊Ca2+-ATP酶性质及其与Ca2+运转的关系，以及外源激素对该过程的影响，旨在对胞内Ca2+参与细胞生理生化过程的方式作进一步的了解。
1 材料与方法
1.1 果肉质膜微囊制备 参照郝鲁宁和余叔文（1992）、Rasi-Caldgno等(1989)的方法略加改动，即先用EGTA去除膜微囊吸附的Ca2+，缓冲液不加ATP。取新鲜苹果（Malus pumila）幼果的果肉30g，按1.5ml/g鲜果肉加入预冷的匀浆缓冲液（mmol/L） ［蔗糖250, KI 125, EGTA 3, Hepes-Tris (pH 7.5)25, 10%（W/V）甘油，0.5%（W/V）聚乙烯吡咯烷酮（30K），0.5%(W/V)BSA, DTT 1, PMSF 1］中，经匀浆化和差速离心，沉淀用匀浆缓冲液洗涤3次；再以少量悬浮液Ⅰ（mmol/L） ［蔗糖250, Hepes-Tris (pH 7.2)2.5,10%（W/V）甘油，0.2%(W/V)BSA, DTT 1］悬浮，此为微粒体膜制剂。连续线性（20%～45%）和不连续（28%，34%和45%）蔗糖密度梯度离心，梯度时间分别为15和2h，收取34%～45%蔗糖浓度界面，此为纯化质膜制剂。
梯度离心样品经悬浮液Ⅱ（mmol／L） ［KCl 125, Hepes-Tris (pH 7.5)2.5, DTT 0.2］悬浮后，80000×g差速离心30min，将等体积少量悬浮液Ⅱ和Ⅲ（mmol/L）［山梨醇250, Hepes-Tris 2.5(pH 7.5), DTT 0.2］混合，用混合液在0℃下处理所得沉淀15min，再以悬浮液Ⅲ稀释，得到密闭质膜微囊制剂。样品用液氮保存，3d内进行Ca2+运转观察，并进行有关酶活性与膜蛋白含量的测定。
1.2 跨膜Ca2+转运测定 参照Rasi-Caldgno等(1989，1992)、郝鲁宁和余叔文（1992）的方法略加修改。标准的测定系统组成（mmol／L）：山梨醇250, Hepes-Tris (pH 7.5)25, KNO3 100, NaN3 0.4, MgSO4 3, ATP 3或在ATP浓度实验中根据需要设定，CaCl2 50μmol/L或与EGTA 0.5mmol/L 形成一定的游离Ca2+浓度的缓冲体系(含0.5μCi的45Ca2+，需按实际同位素比活折算出加入45Ca2+量)；外源激素处理中激素浓度(mg／L): IAA 50，NAA 50,GA 50；加入50μl 膜制剂（含10～30μg膜蛋白）。于25℃下启动反应，系统终体积为0.2ml。反应一定时间后，立即加入1ml终止液（mmol/L）［蔗糖250, Hepes-Tris (pH 7.5) 25, MgSO4 2, EGTA 2］终止反应。精确吸取反应液1.0ml，加至微孔滤器滤膜上真空超滤。滤膜孔径0.22μm，预先用CaCl2 1mmol／L代替EGTA的终止液浸泡至少1h。2ml终止液清洗滤膜3次，置红外灯下烘干。烘干的滤膜浸入5ml闪烁液中，用Beckman LS-9800闪烁计数器测定同位素量。微囊对45Ca2+的主动吸收量需扣除不加ATP时的被动吸附部分。
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