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甲基硝基亚硝基胍诱发的遗传不稳定细胞DNA聚合酶 mRNA表达水平研究 |
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的改变；甲基亚硝基脲(N-methyl-N-nitrosourea, MNU)诱导的小鼠胸腺淋巴瘤细胞中发现有DNA复制保真度下降及pol β mRNA水平升高［8］；对烷化剂耐受的肿瘤细胞中也发现pol β表达水平改变［9］。为明确MNNG诱发的遗传不稳定细胞中是否有pol β表达水平的改变，我们对0.2 μmol/L MNNG处理后的人宫颈癌HeLa细胞，及猴肾vero细胞中pol β mRNA水平进行了研究。
材料与方法
一、细胞培养及处理：
单层生长的HeLa,vero细胞培养于含10%小牛血清的DMEM培养基(Gibco)中。用0.2 μmol/L MNNG(Sigma, 0.1% 二甲基亚砜DMSO作溶剂)处理细胞2.5 h后，经彻底漂洗，加入新鲜培养基，分别培养一定时间，对照组细胞用0.1% DMSO处理2.5 h。
二、PCR引物合成：
根据Genbank公布的人类基因序列，合成人pol β及β2-微球蛋白基因(β2m) 等二对PCR引物(上海细胞所)。其中pol β引物分别为：5’-CTT TGA GAA GAA CGT GAG CC-3’(正义)，5’-CTC GTA TCA TCC TGC CGA AT-3’(反义)，PCR产物长210 bp; β2m引物分别为：5’-C ACC CCC ACT GAA AAA GAT GA-3’(正义)，5’-C ATC TTC AAA CCT CCA TGA TG-3’(反义)，PCR产物长120 bp。
三、定量RT-PCR分析基因mRNA表达水平：
用TRIZol试剂(Gibco)按厂家说明书上方法提取HeLa细胞总RNA。取2 μg细胞总RNA， 0.5 μg d(N)6随机引物，200 μmol/L-MLV逆转录酶(Promega)，25 μL总体积，37℃反应1.5 h逆转录反应合成cDNA第一链。
取对照组细胞逆转录产物2.5 μL， 20 pmol pol β及内参照β 2m基因PCR引物，总体积50 μL，对两基因同时进行PCR扩增。扩增条件：94℃ 1 min, 57℃ 35 s, 72℃ 1 min。从20个循环数起，每增加3个循环数进行一次PCR扩增，直至40个循环数为止。产物经3%琼脂糖凝胶电泳后，溴乙锭染色，紫外灯下拍照，对产物电泳条带进行光密度扫描，计算pol β和β2m条带光密度比值(OD polβ/OD β2m)，以确定PCR定量扩增靶基因的合适循环数。
分别取各处理组细胞逆转录产物2.5 μL，严格按上述条件和选定的合适PCR循环数，对pol β和β2m基因同时进行扩增。PCR产物按上述方法进行定量分析，pol β基因表达水平以pol β和β2m PCR产物电泳条带光密度比值(OD pol β/OD β2m)来表示。各样本至少重复3次RT-PCR过程。
按上述方法，利用人β2m， polβ基因PCR引物对MNNG处理后的vero细胞中polβ基因mRNA水平进行定量分析。
结 果
以β 2m基因为内参照，扩增对照组HeLa细胞中polβ基因。对经溴乙锭染色的产物电泳条带进行光密度扫描，发现从23至32个循环间，polβ和β2m基因PCR产物条带光密度比值(OD polβ/ODβ2m)恒定。表明在此循环数范围内，polβ和β2m基因均呈指数扩增，适合作定量分析。故此选定27个循环数作为定量RT-PCR扩增的循环数(图1)。
Fig 1 RT-PCR products of DNA polymerase β and β2-microglobin in HeLa cells after amplification with different PCR cycle numbers. Lane 1: pGEM-7zf(+)Hae Ⅲ marker. OD polβ/OD β2m: L上一页 [1] [2] [3] 下一页
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