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面口部炎症刺激增强CGRP mRNA PPTAmRNA及NOS在大鼠三叉神经节中的表达 |
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武胜昔 王亚云 李云庆 施际武
(第四军医大学解剖学教研室、梁琚脑研究中心，西安 710032)
摘 要 为了研究CGRPmRNA、PPTAmRNA和NOS在伤害性刺激后大鼠TG中合成和表达的变化，将4%鹿角菜胶(CAR)溶液注射到大鼠一侧口周皮下作为伤害性刺激模型，用NADPH-d组织化学法结合CGRP、PPTA mRNAs原位杂交组织化学法对此进行了观察。结果显示：对照组大鼠TG中约有32.2%、16.2%和10%的神经元分别呈CGRPmRNA、PPTAmRNA和NOS阳性。CAR刺激后，在刺激侧TG、CGRPmRNA、PPTAmRNA和NOS阳性神经元的数量均增多，其阳性率分别达到了38.6%、22.8%和14.2%。TG中约有6.8%和7.3%的神经元同时呈NOS和CGRP mRNA或NOS 和PPTA mRNA 阳性，CAR 刺激使得两种双标神经元的数量也明显增多，双标细胞占TG细胞总数的百分比分别达到了11.0%和10.9%，而且刺激后增加的NOS阳性神经元主要为双标神经元。上述结果提示CGRPmRNA、PPTAmRNA和NOS阳性神经元，尤其是共存神经元可能在面口部伤害性信息的传递和调节中起重要作用，伤害性刺激所诱导的NOS合成的增加与CGRPmRNA和PPTAmRNA表达的增强可能有密切的关系。
关键词 CGRPmRNA PPTAmRNA 一氧化氮合酶 三叉神经节 伤害性刺激 组织化学 原位杂交组织化学
P物质(SP)和降钙素基因相关肽(CGRP)是与伤害性信息传递有关的神经递质，在三叉神经节(TG)中存在着大量的SP和CGRP免疫阳性神经元［1］。编码SP的前原速激肽A(PPTA)mRNA和CGRP mRNA 在TG中也有高水平的表达［2，3］。外周给予伤害性刺激，如皮下注射福尔马林，鹿角菜胶和完全福氏佐剂等可以增强SP和CGRP及其前体mRNA在背根节(DRG)或TG初级传入神经元中的表达［4，5］。一氧化氮(NO)是一种新型的内源性的神经信息物质，在中枢神经系统的信号转导中起着重要的作用［6］。利用还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶(NADPH-d)组织化学方法，可以显示一氧化氮合酶(NOS)在神经系统的分布状况，从而确定NO的生成部位［7］。在TG中存在着NOS阳性神经元，而且NOS和SP或CGRP可共存于TG神经元［8，9］。以往的研究表明，伤害性刺激反应的产生有赖于NMDA受体的激活和NO的产生，外周伤害性刺激条件下，脊髓背角NOS的含量明显增多［6］，说明NO在伤害性信息的中枢处理和调控中起着非常重要的作用。但是在面口部伤害性刺激条件下，NOS在TG中的变化以及与PPTA和CGRP mRNA 表达的关系，还是一个需要探讨的问题。本研究利用NADPH-d组织化学技术结合 PPTA mRNA、CGRP mRNA原位杂交技术，对上述问题进行了研究。
材料和方法
1.动物准备
SD大鼠12只，体重250～300g，分成2组。第1组(8只)为实验组，在乙醚麻醉下将150μl含4%鹿角菜胶(carrageenan,CAR;Sigma)的生理盐水注射到左侧口周皮下；第2组(4只)为对照组，在乙醚麻醉下，将150μl生理盐水注射到左侧口周皮下。各组大鼠均存活3d后处死。
2.探针标记
实验所用CGRP和PPTA探针均为寡核苷酸探针，分别含35和30个碱基。其序列分别与大鼠脑内各自相应的mRNA的一部分(自第664号碱基到第698号碱基和第175号碱基到第204号碱基)相互补。用3′末端标记法及［α-35S］dATP(Amersham)进行标记。标记探针的特异性比放射性为(1.6～2.0)×109dpm/μg。
3.NADPH-d组织化学反应和原位杂交组织化学反应程序
戊巴比妥钠深麻下，经左心室插管至升主动脉，先用100ml生理盐水冲净血液，然后用含4%多聚甲醛的0.1 mol/L PB(pH7.4)500ml灌注固定。取双侧TG，置同样固定液中后固定30min(4℃)，再移入含30%蔗糖的0.1mol/L PB中(4℃)过夜。恒冷箱切片机水平冻切，片厚20μm，切片分成2组收集。第1组行Nissl染色；第2组行NADPH-d组织化学法结合CGRP mRNA和PPTA mRNA原位杂交法处理反应。具体过程如下：切片入含0.5g/L β-NADPH(Sigma,Type Ⅳ)，0.6g/L硝基四氮唑蓝(NBT)[1] [2] 下一页
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