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人乳头瘤病毒16型致瘤基因E6在昆虫细胞中表达及其蛋白抗原特性的初步研究 |
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种重要的致瘤DNA病毒，近年来，发现非上皮性肿瘤如多发性骨髓瘤的发生也与HPV感染有关。HPV16 E6基因是重要的转化基因之一。
HPV16 E6蛋白的致癌机理一直是本领域研究的热点。研究表明，HPV16 E6蛋白与P53相互作用，导致P53降解，从而引起细胞周期紊乱，DNA损伤累积造成细胞癌变〔1〕。由于HPV尚不能体外培养，严重阻碍了HPV免疫学，流行病学及疫苗开发的深入研究。国内外均采用基因克隆技术，通过基因表达对HPV进行研究。因此，研制基因工程E6蛋白可为HPV的分子生物学和肿瘤病毒病因学的深入研究打下基础。
杆状病毒表达系统与其它蛋白表达系统相比有一定的优越性，特别是对动物和人类细胞没有致病性〔2〕。本研究旨在研制杆状病毒来源的HPV16 E6表达蛋白，为进一步研究野生型E6蛋白的免疫学特性及其在肿瘤免疫学诊断方面的应用奠定基础。
材料与方法
1.酶类、质粒和抗体：限制性内切酶、T4 DNA连接酶，Taq DNA聚合酶，羊抗兔，羊抗人辣根过氧化物酶标记抗体均购于华美生物工程公司。pBR322-HPV16、兔抗HPV16 E6抗体ZY96A由美国华盛顿大学Galloway教授惠赠。DIG-DNA标记和检测试剂盒购于德国Boerhringer mannheim公司。pVL1393系Invitrogen公司产品。
2.病毒与细胞：昆虫细胞Sf-9在TNM-FH昆虫细胞培养基(Sigma)和10%胎牛血清(GIBCO BRL)中27℃培养。线性核多角体病毒AcMNPV系Invitrogen公司产品。野生型核多角体病毒wdAcMNPV由上海细胞所惠赠。
3.基因扩增：按照HPV16序列〔3〕设计引物，在翻译起始密码子ATG之前及终止密码子TAA之后设计加入BamHⅠ酶切位点以便于克隆。
P1:5 GGCTGGATCCGAACCGAAACCGG3 ；
P2:5 CGCTGGATCCGTAGGTGTATCTCC3 。
以pBR322 HPV 16为模板，加入dNTP和Taq DNA聚合酶，进行PCR扩增。PCR反应按常规方法略加修饰。反应参数为94℃40秒，60℃ 50秒，72℃120秒，循环35次，最后一次延伸为72℃6分钟.扩增产物长度约为555bp。
4.PCR产物测序：PCR扩增产物和质粒pUC18分别经BamHⅠ酶切，T4 DNA连接酶连接，转化大肠杆菌JM109，筛选阳性重组质粒，经QIAGEN公司质粒快速纯化系统纯化后，采用ABI377自动测序仪进行测序分析。
5.重组转移载体的构建：BamHⅠ酶切重组质粒回收E6基因片段，与经BamHⅠ酶切的pVL1393连接，转化感受态E.coli DH5α。工程菌扩增并提取质粒DNA，用E6特异性引物进行PCR，筛选出重组克隆。然后用EcoRⅠBamHⅠ和PvuⅡ分别酶切分析，获得E6基因定向正确的克隆。
6.重组杆状病毒的筛选与纯化：重组转移载体DNA与线性核多角体病毒DNA混合，按磷酸钙共沉淀法〔4〕共转染昆虫细胞SF-9，27℃培养4～5天，收集上清液，通过4代连续噬斑纯化得到重组病毒，并用DIG标记的HPV16 E6 DNA探针进行噬斑原位杂交，鉴定重组病毒株。
7.表达产物的测定：感染重组杆状病毒株和野生病毒株的Sf-9细胞进行常规15%SDS-PAGE检测表达产物，将凝胶中蛋白转印至硝酸纤维素膜上，加兔抗HPV16 E6抗体(1∶400稀释)及辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG，DAB显色，用C-R4A高效液相色谱仪，流动相0.1mol/L PBS,pH6.6，流速0.5ml/分钟，波长280nm，柱压29Kgf/cm2，收集洗脱峰进行高效液相色谱法测定。
8.酶联免疫吸附试验(ELISA)： 重组病毒感染72小时的SF-9细胞用超声波破碎，低速离心取上清，加33%硫酸铵4℃ 4小时，500r/min 离心30分钟，沉淀溶于2ml的碳酸盐包被液(pH 9.8)中,每孔100μl，包被40孔酶标板，并用含小牛血清的Tween-PBS缓冲液封闭1.5小时。HPV16阳性血清1∶40至1∶320稀释后，每孔100μl，37℃60分钟。洗板后加入辣根过氧化物酶标记羊抗人IgG，OPD显色，在492nm波长下用DG-3022A型酶联免疫检测仪测定吸光度(A)值。
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