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人亲环素A基因的克隆及在大肠杆菌中的表达 |
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李芳秋 赵权 武建国 单祥年
作者单位：210002 南京军区南京总医院全军医学检验中心分子生物学实验室
〔李芳秋(南京师范大学生物系博士研究生)，赵权，武建国〕；
南京师范大学生物系(单祥年)
环孢素A(CsA)是防治器官移植免疫排斥及自身免疫病的重要药物，该药发挥作用必
须由体内受体蛋白，即亲环素(CyP)来介导。CyP是一个功能相关的蛋白家族，具有肽基脯氨
酸顺/反异构酶(PPIase)活性，能催化细胞内蛋白质的折叠、装配和运输〔1〕。CyP自身抗
体与某些自身免疫病也有关系〔2〕。亲环素A(CyPA)是免疫抑制剂CsA在体内的主要受体蛋
白。本研究对CyPA基因进行了克隆和序列测定，并构建了表达载体，在大肠杆菌中获得高水
平表达。
材料和方法
细胞与载体：MT4淋巴细胞系，M13载体及大肠杆菌JM103菌种，pET11c载体及宿主
菌BL21(DE3)。
工具酶与试剂：限制性内切酶、T4 DNA连接酶、X-gal、IPTG均购自Promega公司。R
T-PCR试剂盒购自美国PE公司。质粒和PCR产物纯化试剂盒QIAGEN公司产品。N-succin
yl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitronitide、糜蛋白酶购自Sigma公司，DEPC、异硫氰酸
胍、十二烷基肌氨酸钠购自Serva公司，DEAE Sepharose CL-6B购自Pharmacia公司。
寡核苷酸引物：根据文献〔3〕，设计出CyPA cDNA引物序列。上游引物PRI-A1 5C
GGGAATTCATAT
GGTTAACCCCACCGTGTTCTTCGAC，含EcoRⅠ和NdeⅠ位点，下游引物PRI-A2 5AT
GCAAGCTTG
GATCCTTATTCGAGTTGTCCACAGTCAGC，含
Hind Ⅲ和BamH Ⅰ位点。
重组人CyPA(rhCyPA)标准品：购自Boehringer Mannheim公司。
总RNA提取：取一大瓶生长良好的MT4淋巴细胞，离心去上清，采用异硫氰酸胍法提取总
RNA。
RT-PCR反应：取3μl(1μg左右)的总RNA，65℃变性3分钟，依次加入5mmol/L Mg
Cl2, 50mmol/L KCL,10mmol/L pH8.3 Tris-HCl,1mmol/L dNTPs,
1U/μl RNase抑制剂，2.5μmol/L random hexamers,2.5U/μl反转录酶，反应总体
积20μl。42℃30分钟，95℃5分钟。PCR采用双温法，在PE9600型PCR扩增仪中扩增3
5个循环。取5μl产物用琼脂糖电泳检查特异条带，按QIA quick试剂盒说明书纯化PCR产
物。
DNA重组与鉴定：重组DNA技术按分子克隆实验手册进行。
DNA序列分析：在ABI 377型DNA序列分析仪上完成。
诱导CyPA基因表达：重组表达质粒转化大肠杆菌B21(DE3)，接种于LB/Ap培养液，3
7℃培养3～4小时至吸光度A600为0.5～0.6，加IPTG至终浓度为1 mmol/L诱导表达，3
7℃培养12小时，定时取样测A600吸收，离心收集菌体，按A值加入SDS-PAGE载样缓冲液，
煮沸5分钟，取15μl上样，进行SDS-PAGE分析不同时间的表达量。
SDS-PAGE：12%的聚丙烯酰胺凝胶电泳，用考马斯亮蓝染色。用双波长飞点扫描仪(岛津
CS-9000)对凝胶进行扫描，计算蛋白表达量。
表达产物的纯化和活性测定：pET11/CyPA质粒转化菌经IPTG诱导后离心收集菌体，
超声波破碎细胞，离心去除菌体碎片，用50%饱和硫酸铵沉淀蛋白，透析去除铵离子。透析
过的细菌粗提物再用DEAE-Sepharose CL-6B柱层析纯化。洗脱液为20mmol/L,pH7.8
Tris-HCl，收集流[1] [2] 下一页
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