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血管紧张素 和血小板源生长因子对心肌细胞周期素和p27蛋白表达量的调节 |
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成熟心肌细胞再进入细胞周期将会对心衰起到有益的治疗作用［3］。寻找调控心肌细胞增殖信号转导的关键点，对促进心肌细胞的增殖将有非常重要的意义。
促进或抑制细胞增殖是通过促进或抑制细胞周期而实现的，细胞周期素(cyclin)和CDK抑制蛋白(cyclin dependent kinase inhibitor, CKI)是对细胞周期起正性和负性调节作用的两类物质［4］。p27蛋白是CKI的一种，在对肿瘤细胞的研究中发现：p27蛋白主要对细胞外部促进或抑制增殖的信号起反应，在静止细胞中p27蛋白具有相当高的表达，而在增殖细胞中表达却减低，提示p27蛋白可能是各种调节细胞增殖信号的关键性因子［5］。但是，p27蛋白和细胞周期素在心肌细胞中的作用目前尚不清楚。
血管紧张素II(angiotensin Ⅱ, AngII)、血小板源生长因子BB(platelet derived growth factor BB, PDGF-BB)是体内存在的强有力的细胞因子，在心室重构中可能起重要作用。本研究以AngII和PDGF为代表，应用流式细胞仪(FCM)观察其对心肌细胞细胞周期素和p27蛋白表达的影响，说明在心室重构信号转导过程中p27和细胞周期素的重要作用。
材料与方法
(一)材料：AngⅡ、PDGF-BB、碘化丙啶（PI）购于美国Sigma 公司，DMEM、胰蛋白酶、胎牛血清购于美国GIBCO公司，抗p27单克隆鼠抗人抗体(一抗)、抗cyclin A、cyclin D、cyclin E单克隆鼠抗人抗体(一抗)由美国哈佛大学麻省总医院病理科Dr.Wu惠赠，荧光标记羊抗鼠抗体(二抗)购于军事医学科学院，流式细胞仪Elite型(美国Coulter公司)。
(二)心肌细胞的培养及处理： 新生1 d Sprague-Dawley(SD)大鼠(由本院动物所提供)，无菌取出心室，0.06%胰蛋白酶37℃水浴中消化20 min，离心分离出细胞加2 mL培养液，置细胞悬液于深的玻璃平皿中，在37℃孵箱中静置，3 h后，非心肌细胞沉至平皿底贴壁，而心肌细胞仍在细胞悬液中，此时细胞悬液中心肌细胞比例大于95%，吸出细胞悬液，转入培养瓶中培养。实验所用细胞为培养3 d后的原代细胞。实验前24 h换成含1%FBS的DMEM。这种DMEM能使心肌细胞在一段时间内处于静止的非代谢状态，细胞数目稳定，这样可使用于实验的细胞处于同一生长水平。所有处理细胞的药品均先加在DMEM中，12 h给予更换。
(三)流式细胞仪双标法测定［6］：将培养的细胞收集起来，用注射器将细胞迅速注入4℃冷1%甲醛中，5 min后加入99%的甲醇30 min，然后将细胞加入到4℃的PBS液中，其中含0.1%(v/v) Triton-100和0.1%柠檬酸钠, 冰浴45 min，细胞分别加入特异的第一抗体抗p27或抗 cyclin A、cyclin D、cyclin E(鼠抗人)50 μL，空白(PBS 50μL)，室温放置2.5 h，用PBS 2 mL洗两次，加入异硫氰荧光素(FITC)标记的第二抗体50 μL(羊抗鼠)，37℃孵育30 min，空白对照中加入标记的二抗作为背景荧光。再加入RNA酶37℃水浴30 min除去RNA。加入PI染液，终浓度为20 μg/mL，暗处冰浴30 min。上机前用孔径40 μm的尼龙网过滤。
PI和FITC被激发出的荧光互不影响，因此，根据PI所标记的DNA含量可以确定细胞所处的细胞周期，同时根据FITC被激发出的荧光量的多少来确定细胞中不同细胞周期素和p27蛋白表达的相对量。
(四)统计学处理：数据用均数±标准差()表示，两组之间用配对t检验，多组百分率比较用u检验。
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