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生长因子对成年大鼠肺泡 型细胞增生的影响 |
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express the stimulating effect as used alone,but the inhibiting effect of TGF β1 was demonstrated.On the contrary,when TGFβ1 was added first,then addition of TGFα exhibited significantly stimulative effect. Conclusion Special growth factors including EGF,TGFα,and TGFβ1 have been implicated in the regulation of proliferation of cultured alveolar type Ⅱ cells isolated from adult rat.
【Key words】 Epidermal growth factor; Transforming growth factor alpha; Transform
ing growth factor beta; Platelet derived growth factor; Basic fibroblast growth fact
or; Alveolar type Ⅱ cell; Rat
肺泡Ⅱ型细胞是肺泡上皮的干细胞，参与肺生长发育、损伤修复过程。已有研究表明，人及动物肺损伤病变中均出现肺泡Ⅱ型细胞增生，本室研究发现，成年大鼠吸入石英粉尘或有机粉尘可致肺泡Ⅱ型细胞数量增多，体积增大［1，2］。
近年有关生长因子参与肺泡Ⅱ型细胞增生的体内外实验研究已有一些报道［3，4］，由于肺泡Ⅱ型细胞分离纯化及培养均有一定的难度，国内尚缺乏体外研究报道，国外的研究主要集中在新生肺和胎肺肺泡Ⅱ型细胞。尚有许多问题有待进一步探讨，如不同年龄动物肺泡Ⅱ型细胞对生长因子反应的差异性；多种生长因子的协同作用对肺泡Ⅱ型细胞的影响；肺泡Ⅱ型细胞与其他肺细胞的相互作用是否受生长因子介导等。本实验用3H-TdR掺入、细胞计数、Ki-67标记指数，探讨表皮生长因子(EGF)、转化生长因子α和β1(TGFα,TGFβ1)、血小板源性生长因子(PDGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对体外培养的成年大鼠肺泡Ⅱ型细胞增生的影响。
材料和方法
1. 肺泡Ⅱ型细胞分离纯化及原代培养
实验动物为体重140～180g雄性SD大鼠共9只(鼠龄3～4月，清洁级)(湘雅医院动物科)。细胞分离培养按我室建立的方法进行［5］。经大鼠IgG(中国军事医学科学院)粘附纯化后的肺泡Ⅱ型细胞，碱性磷酸酶(AKP)染色，细胞纯度在90%以上。实验分3次进行，每次分离3只大鼠细胞供实验用。
2. 3H-TdR掺入
纯化后的肺泡Ⅱ型细胞用含20%FCS(杭州四季青生物材料研究所)的DMEM(Gibco/BRL)培养基调节细胞浓度至7×105个/ml，按4×105细胞/cm2的密度接种于24孔培养板中(相当于每孔1ml悬液)，置5%CO2培养箱中培养24h。去除未贴壁细胞，更换含10%FCS的DMEM新鲜培基，同时加5μCi/ml 3H-TdR(30Ci/mmol,中国科学院上海原子能研究所)及不同剂量(0.01～100μg/L)的生长因子［包括rhEGF,rhTGFα,natural TGFβ1(Promega),rhbFGF(Baehringer Mannheim,B.M)，PDGF-BB(Austral Biologicals)］,同一剂量置3个复平孔。继续培养48h后用0.06%胰蛋白酶/0.01%EDTA消化收集细胞于玻璃纤维滤纸上，10%三氯乙酸固定，无水乙醇干燥。置37℃过夜烘干，将纤维滤纸置于闪烁瓶中加5ml混合闪烁液，Beckman LS3801液闪仪测定DMP值。
3. 细胞计数
肺泡Ⅱ型细胞培养24h，换液后第1次细胞计数作为基数。更换含10%FCS的DMEM再培养48h后对加生长因子的实验孔和未加生长因子的对照孔进行第2次细胞计数。计数方法［6］：在装有目测试格倒置显微镜下，随机计数培养孔中单位面积(1/16mm2)内细胞数，每1实验组计数6个单位面积，取其均值作为该组的细胞密度。
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