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微囊化转TH基因人成纤维细胞脑内移植治疗帕金森病大鼠模型的研究 |
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disease; Gene therapy; Tyrosine hydroxylase; Human fibroblast; Microcapsule; Rat
帕金森病(Parkinson Disease, PD)的主要病理特征为中脑黑质多巴胺(dopamine, DA)能神经元变性，使纹状体内的DA显著减少而出现一系列临床症状。将分泌多巴胺的胚胎中脑细胞或肾上腺髓质细胞进行纹状体内移植，能一定程度地逆转或改善患者的症状。此外，新近发展起来的基因治疗方法，即利用各种转基因技术，将外源性基因如DA合成限速酶-酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)基因转入某种体外培养的细胞内，再将此基因工程细胞植入模型动物脑内，使之在纹状体表达TH［1，2］，而达到提高DA水平的目的。但是，大量研究证明，无论用哪种细胞植入脑内都存在宿主免疫排斥的问题，在进行同种异体基因和异种基因细胞移植中尤为显著［3］。现有报道，将丙烯共聚物微囊植入大鼠脑内诱导的宿主组织反应较小。这种通过分子量界值为50 000道尔顿的微囊半透膜容许营养物质、生长因子和神经递质等小分子自由扩散，但能阻止大分子的免疫球蛋白和宿主细胞跨过微囊膜攻击移植细胞，从而对移植物提供免疫隔离［4］，故用微囊包裹的细胞移植势必大大减少宿主的免疫排斥并提高移植物的存活率。据此，本研究拟对转TH基因的人成纤维细胞进行藻酸盐-多聚赖氨酸-藻酸盐(alginate-poly-lysine-alginate,APA)半透膜聚合物微囊包裹后植入大鼠纹状体内，以探求用成纤维细胞进行脑内异种移植治疗帕金森病实际应用的可能性。
材料和方法
1.大鼠PD模型的建立
将体重190～200g的雌性SD大鼠(首都医科大学实验动物部提供)用6%水和氯醛(0.05ml/kg腹腔注射)麻醉，置于脑立体定位仪行开颅手术；在脑内两点定位注射1%6-OHDA(6-hydroxydopamine, Sigma)各4μl［5］，以损毁脑一侧黑质神经元。术后1周，大鼠颈部皮下注射Apomorphine(0.05mg/kg)，然后置于PD大鼠模型旋转记录仪［6］上进行行为学检测。每周1次，每次40min，连续测量4周；出现向损毁对侧旋转次数大于7圈／min的大鼠可视为PD动物模型，共38只，供脑移植用。
2.运载细胞人成纤维细胞的培养
取临床消毒后流产胎儿(胎龄4个月)皮肤，剪碎后用0.1%胰蛋白酶消化30min，血清中和后离心去上清；Hank液洗1～2遍，用含10%胎牛血清的DEME培养基(DEME／FCS，Gibco／BL)反复吹打，制成细胞悬液；将其按5×105的细胞密度接种于50ml培养瓶中进行培养。
3.带有TH基因的pLhTHSN质粒的重组
用两种DNA，即质粒pLXSN(逆转录病毒载体，海军总医院黄晋生博士惠赠)和质料pRcTH(含人TH基因，由美国Somatix Therapy Corporation提供)构建新的质粒pLhTHSN。用限制性内切酶EcoRI酶切pRcTH,回收并纯化1.8 kb片段作为人TH(hTH)基因的插入片段。用限制性内切酶EcoRI酶切pLXSN，用适量的CIAP进行脱磷酸反应作为逆转录病毒载体。将5.8kb的载体DNA片段和1.8 kb的目的基因片段纯化后，两者按照1∶3～5的比例加入连接反应体系中，在T4 DNA连接酶作用(12℃，过夜)下进行连接反应，两者连接后可使hTH基因插入载体中。然后转化到XL1-Blue大肠杆菌感受态细胞。挑选转化后过夜生长的12个连接转化菌落，用煮沸法从中小量提取质粒DNA，并用限制性内切酶EcoRI、XhoI和BamHI进行酶切和电泳分析，以验证质粒是否携带hTH基因和其插入方向是否正确。经确认后，用碱裂解法大量提取质粒pLhTHSN以用于基因转移。
4.pLhTHSN质粒转染培养的人成纤维细胞
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