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红莲型细胞质雄性不育水稻线粒体DNA的RFLP分析 |
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取水稻黄化苗总DNA。
1.2.2. 线粒体基因探针
表1 线粒体基因探针
基因 片段大小
(kb) 酶切位点 抗性 载体 来源
atpA 4.2 HindIII Amp pUC19 玉米
atp6 2.7 HindIII Amp pUC19 玉米
atp9 2.2 XbaI Amp pUC19 玉米
coxI 10 BamHI Amp pUC19 玉米
coxII 2.8 HindIII Amp pUC19 玉米
cob 5.6 BamHI Amp pUC19 小麦
26Srrn 1.5 SstI Amp pUC19 小麦
5S-18Srrn 0.5 HindIII/EcoRI Amp pUC19 玉米
所使用的8个线粒体基因探针列于表1。参照《分子克隆实验指南》［6］，“碱裂解法”提取质粒DNA，用相应的内切酶进行酶切反应，从低融点琼脂糖凝胶中回收探针DNA，随机引物法标记探针。
表2 粤泰A,粤泰B,泰优2号线粒体DNA Souther杂交结果
探针限制 atpa atp6 atp9 coxI coxII cob 5S-18Srrn 26Srrn
YA YB YF1 YA YB YF1 YA YB YF1 YA YB YF1 YA YB YF1 YA YB YF1 YA YB YF1 YA YB YF1
BamHI 23 23 9.4 9.4 9.4 12.6 12.6 12.6 8.9 12 12 12 [18] [18] [18] 8.9 8.9 8.9
5.3 5.3 5.3 16.7 5.3 5.3 5.3 8.9 8.9 8.9 7.9 7.9 9.8 9.8 [9.4] [9.4] [9.4]
12.5 12.5 1.5 1.5 5.0 5.0 5.0 7.4 7.4 7.4 3.4 3.4 3.4
1.2 1.2 1.2 [5.6] [5.6] [5.6] 1.0 1.0
EcoRI 9.4 9.4 9.4 9.4 9.4 4.5 4.5 4.5 4.2 4.2 4.2 6.0 6.0 14 14 14 6.3 6.3 6.3
2.3 2.3 2.3 [6.1] [6.1] [6.1] 5.8 5.8 5.8 3.7 3.7 4.7 4.7 7.2 7.2 7.2
2.3 1.5 1.5 2.1 2.1 2.1 2.7 2.7 2.7 4.4 4.4 4.4
1.6 1.6 1.0 1.0
HindIII 9.0 5.3 5.3 5.3 8.9 8.9 8.9 9.4 9.4 9.4
4.0 4.0 4.0 7.5 7.5 7.6 7.6 7.6 4.0 4.0 4.0 3.1 3.1 3.1 6.3 6.3 6.3 5.6 5.6 5.6
6.1 6.1 1.5 1.5 6.5 6.5 2.2 2.2 3.7 3.7 3.7
[1.9] [1.9] [1.9] 1.0 1.0 2.4 2.4 2.4 1.8 1.8 1.8
1.2.3 RFLP分析
每份材料取10μg总DNA，分别用限制性内切酶BamHI,EcoRI,HindIII于37℃完全酶切后，0.9％琼脂糖凝胶在1.5V/cm过夜电泳，然后将凝胶碱变性，中和，用磷酸缓冲液进行Southern转移，使用的尼龙膜为HybondN＋膜（Amersham）。预杂交和杂交在65℃进行，严谨洗膜条件为0.1×SSC,0.1％SDS,65℃,60分钟，放射自显影时间根据放射性强度而定。碱液去除探针后，尼龙膜又可用于下一轮杂交上一页 [1] [2] [3] 下一页
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