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人心肌肌钙蛋白T基因的克隆 |
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陈海波 官孝群 宋钢 宋后燕 童步高 诸骏仁
心肌肌钙蛋白T(cardiac troponin T, cTnT)是心肌的特异性抗原，是急性心肌梗塞等严重心肌缺血的血清标志物之一，我们克隆人心肌肌钙蛋白T基因，并实现了在大肠杆菌中的表达，为最终制备抗人cTnT的单克隆抗体奠定了良好的基础。
引产胎儿由上海医科大学妇产科医院提供。引物由Sangon公司合成，分别引入限制性内切酶EcoRI和BamHI的识别顺序及起始和终止密码。序列为：1280引物(5′GC GAA TTC ATG TCT GAC ATA GAA GAG GTG G 3′30 MER) 1281引物(5′ AT GGA TCC TTA TTT CCA GCG CCC GGT GAC TTT 3′32 MER)总RNA提取按RNA一步法提取。cDNA第一链的合成按RT-PCR试剂盒说明书，20 μl体系包括4 μl总RNA，1 μl Oligo(dT)12-18,1μl SuperScript Ⅱ RT, 2 μl 10*PCR buffer, 2 μl 25 mmol/L MgCL2, 1 μl 10 mmol/L dNTP mix, 2 μl 0.1 mol/L DTT, 1 μl RNase H.反应条件：退火70℃，10 min；反应42℃，50 min；灭活70℃，15 min。反应结束后取第一链产物2 μl作为PCR扩增cTnT基因的模板，100 μl体系包括1280，1281引物各1 μl(25 pmol/L)，1 μl(3u/ul) Taq DNA聚合酶，10 μl10*PCR buffer, 6 μl 25 mmol/L MgCL2，2 μl 10mmol/L dNTP mix。扩增程序：94℃变性，60℃退火，72℃延伸各一分钟，30个循环后72℃维持5分钟。cTnT基因的克隆：RT-PCR产物经Klenow大片段催化补平末端，BamHI和EcoRI双酶消化，回收约0.9 kb的片段。pU C18载体经BamHI和EcoRI双酶消化，回收约2.7 kb的片段。两片段连接，转化大肠杆菌JM109。cTnT基因序列分析：序列分析按SequenaseR试剂盒(Version 2.0)说明书，引物分别为pUC18/M13正向和逆向引物。双向测序按Sanger双脱氧法。cTnT基因全长约0.9 kb，双向测序难以测其全长。cTnT基因中有一SacI位点，我们在EcoRI-SacI，SacI-BamHI之间又构建两个亚克隆，以测cTnT基因全序列。
RT-PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定，可见清晰的约900 bp条带，符合cTnT基因的长度，阳性克隆酶切鉴定证明扩增片段已重组至pUC18载体。1993年Mesnard等首次发表了成人cTnT的完整克隆，全长866 bp.cTnT有4种异型。1995年Anderson等成功构建四个完整克隆，分别编码四种cTnT，按分子量从大到小分为：cTnT1，cTnT2，cTnT3，cTnT4。四种蛋白质的氨基酸排列顺序区别在于第17位至第33位氨基酸之间有不同的插入顺序。cTnT1和cTnT2分别有15个氨基酸和10个氨基酸插入，两者均在胎儿心肌中表达，而cTnT2表达水平很低。cTnT3有五个氨基酸插入，是成人心肌中的主要成分。cTnT4无插入顺序，一般只在胎儿心肌中表达，但成人心力衰竭时又见表达。造成四个cTnT异型的原因在于同一基因转录后不同的剪接方式，而不是由于不同的基因编码。我们的序列分析已表明克隆全长cTnT基因，全长897 bp，编码cTnT的298个氨基酸，属于Anderson等分型的cTnT1。根据Sambrook等的报道，从少量mRNA生成cDNA文库，错配率可达0.25%。我们用RT-PCR扩增cTnT基因，发现第348位核苷酸发生点突变，ATT突变为ATC，但编码异亮氨酸未变。用传统的方法从心肌组织中分离纯化cTnT非常复杂且产量有限，高效表达载体PLY-4的成功研制，使通过基因工程技术直接获得cTnT成为可能。
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