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表达人自身抗原SSB La重组体的构建及其鉴定 |
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邓安梅 仲人前 孔宪涛
系统性自身免疫病的特征之一是循环中出现一些抗核蛋白的自身抗体。多数自身抗体，除抗 DNA抗体外，在自身免疫病的病理机制中并无直接作用。然而，特异性自身抗体与相应的自身免疫病病情高度相关。探讨自身免疫病中的抗原抗体作用有助于我们了解自身免疫病的发病机制，为疾病的早期诊断及治疗打下基础。自身抗原SSB/La可被干燥综合征(SS)、系统性 红斑狼疮(SLE)等自身免疫病患者的血清识别［1］，但其抗原表位的精确定位、表位 与疾病相关性的分析等方面尚存在分歧［2，3］。本课题旨在构建表达人自身抗原SSB/La的重组体，进一步在大肠杆菌中表达重组抗原，为深入研究疾病的发病机制奠 定基础。
1 材料及方法
1.1 质粒、菌株、酶及所用试剂：PGEX-2T质粒；JM 109菌株；AMV逆转录酶；Taq DNA多 聚酶、EcoRⅠ内切酶、BamHⅠ内切酶、T4DNA连接酶(Pharmacia)；QIAprep Spin Plasmid M iniprep Kit DNA Purification。
1.2 用逆转录－PCR方法克隆SSB/La的cDNA：检索EMBL库，根据引物设计的主要标准 ［4］设计用于特异性扩增SSB/La的一对引物。这对引物的5′分别添加了合适的内切酶位 点序列，便于使克隆基因片断与表达型质粒载体PGEX－2T定向拼接并确保读码框架的正确。 引物交中国科学院细胞研究所合成、纯化。
3′端引物为：5′GGCGAATCCCTGGTCTCCGGCACCATT 3′
EcoRI
5′端引物为：5′AAGGGATCCTACCGACTTTTACCACTA
BamHI
Hela细胞培养及其RNA的抽提参照异硫氰酸胍法进行［5］。
取细胞总RNA 10 mg，3′端引物0.8 μmol/L(终浓度，以下同)，70 ℃加热5分钟，然后依 次加入RNasin 20 μl，4种dNTP各1 mmol/L，AMV逆转录酶25 μl以及逆转录反应缓冲液， 总体积25 μl，42 ℃保温1小时。在上述逆转录反应产物25 μl中加入MgSO4 6 mmol/L， 4种dNTP各200 mmol/L，5′端引物0.2 μmol/L以及Taq DNA聚合酶缓冲液，混匀后100 ℃ 加热5分钟。冷却至72 ℃加入Taq DNA聚合酶2 μl。PCR热循环条件：变性94 ℃持续30秒， 退火65 ℃持续30秒，延伸72 ℃持续2分钟，共计30个循环，最后在72 ℃中延伸10分钟。扩 增产物经溴化乙锭—琼脂糖凝胶电泳检测。
1.3 SSB/La重组体的构建与鉴定：用BamHI和EcoRI内切酶双酶切表达载体PGEX-2T和PCR 产物，经T4DNA连接酶作用，室温过夜。将连接产物用CaCl2法转导入JM 109菌株中，并涂 布于LB/Amp平板，37 ℃孵育过夜。挑取LB/Amp平板上菌落，提取质粒，用BamHI和EcoRI内 切酶双酶切，并经琼脂糖凝胶电泳，鉴定能切出1.2 Kb酶切小片段的重组克隆，以备进一 步表达鉴定。提取重组克隆的质粒，用上述特异性引物经PCR扩增，产物经琼脂胶糖电泳。
1.4 DNA测序：将上述所选克隆用Taq酶Sanger双脱氧链末端终止法测序［6］。
2 结 果
2.1 SSB/La cDNA的克隆：逆转录－PCR反应产物的琼脂糖凝胶电泳显示，在分子量约为1.2 Kb的位置可见清晰的特异性扩增条带。用酶切法和PCR法证实载体PGEX-2T中含有以正 确方向嵌入，符合预期长度的目的基因SSB/La cDNA。
2.2 DNA序列测定：DNA测序结果表明该克隆为SSB/La cDNA，与EMBL库中检索到的人SSB/La基因序列相一致。本研究得到的人La cDNA克隆，包含1 224 bp的开放阅读框，由此推断的 蛋白质含408个氨基酸，分子量为46 784。与国外报道［7］的人La cDNA克隆相比，在a.a.666位的A→G，在a.a.723位的T→C，而所编码的氨基酸均不变。
3 讨 论
本课题在对靶基因(SSB/La的核苷酸序列)进行cDNA克隆中，[1] [2] 下一页
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