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多聚酶链反应诊断生殖支原体感染的研究 |
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常哲 吴移谋 余敏君 肖建华 张艳
生殖支原体(Mg)与急、慢性非淋菌性尿道炎(NGU)、慢性前列腺炎、宫颈炎或盆腔炎、不育症等疾病［1］有关。Mg的生长极其缓慢，初代生长时间长，需要的营养成分复杂，从临床标本中分离培养Mg难度大，阳性率很低。血清学诊断因与肺炎支原体(Mp)有交叉反应而特异性差。为评价聚合酶链反应(PCR)方法检测Mg的可靠性，了解Mg在衡阳地区高危人群中的感染状况，我们在MgPa基因上选择了3对不同的引物，用PCR方法对泌尿生殖道感染患者的标本进行了Mg检测，现将结果报告如下。
材料和方法
一、标准菌株
生殖支原体(Mg,G-37)、肺炎支原体(Mp)、解脲支原体4型(Uu4)、人型支原体(Mh)、唾液支原体、口腔支原体、螺原体(CR，CH-1)、大肠杆菌、绿脓杆菌、枯草杆菌(以上均为我室保存国际标准菌种)，淋球菌(NG系临床分离株)，沙眼衣原体(CT)L2标准血清型(模板DNA由加拿大易亚军博士惠赠)。
二、标本采集
收集1996年12月～1997年10月衡阳市各医院性病门诊拟诊为非淋菌性尿道炎、阴道炎、宫颈炎、慢性前列腺炎等泌尿生殖道感染患者标本200份。其中男147例，年龄17～64岁，平均31岁，女53例，年龄18～43岁，平均28.5岁。男性标本涂片镜检白细胞＞5/HP,女性标本涂片白细胞>20/HP。
三、引物合成
参照De Barbeyrac等［2］、Jensen等［3］、Palmer等［4］依据Mg 140 000粘附素(MgPa)基因序列设计的Mg引物，由中国科学院上海生物工程研究中心合成：MgPa1/MgPa3、Mg1/Mg2及MGS-1/MGS-4。引物序列见表1。
表1 MgPa基因引物资料
引物名 序列(5′→3′) 基因中位置 产物长
度(bp) 酶切片
段(bp) 酶切
位点
MgPa1 AGTTGATGAAACCTTAACCCCTTGG 179～206 281 45(Alu I) 315
MgPa3 CCGTTGAGGGGTTTTCCATTTTTGC 435～460 236
MGS-1 GAGCCTTTCTAACCGCTGC 38～56 371 96(EcoR I) 315
MGS-4 GTTGTTATCATACCTTCTGAT 388～408 277
Mg1 TGTCTATGACCAGTATGTAC 3 837～3 856 374 84(EcoR I) 4 182
Mg2 CTGCTTTGGTCAAGACATCA 4 190～4 210 290
四、DNA模板的制备
支原体、其它菌种DNA模板提取方法见文献［2］。
五、PCR扩增
扩增反应体系总体积为50μl，其中含模板10μl，TaqDNA聚合酶2U，引物各1μmol/L，200μmol/L的每种dNTPs，1×PCR缓冲液(50mmol/L KCl，10mmol/L Tris(pH9.0)，1.5mmol/L MgCl2，0.01%明胶，0.1%TritonX-100)。灭菌双蒸水补足50μl，上覆矿物油50μl。95℃预变性5分钟，PCR反应温度及时间分别设置为：引物MgPa1/MgPa3 95℃变性1分钟，52℃复性1分钟，72℃延伸1分钟；引物Mg1/Mg2 95℃变性1分钟，45℃复性1分钟，72℃延伸1分钟；引物MGS-1/MGS-4 95℃变性1分钟，55℃复性1分钟，72℃延伸1分钟。3对引物PCR分别都进行35个循环，在最后1个循环将延伸时间延长至6分钟。每份标本分别行3对引物的扩增反应。每次试验应设立阴性及阳性对照，阴性对照加灭菌双蒸水作模板，阳性对照加Mg G-37模板DNA。
结果判断：取扩增产物10μl在2%琼脂糖凝胶中(含0.5μg/ml的溴化乙锭)进行电泳。在透过式紫外灯下观察结果并照相。出现预期长度的扩增片段或和阳性对照平行的DNA扩增带为PCR阳性。
六、特异性和敏感性试验
在特异性试验中使用Mp、Uu、Mh、NG、CT等病原体与Mg G-37模板一道分别行3对引物的MgPa基因PCR。敏感性试验中[1] [2] 下一页
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