慢性乙型肝炎患者外周血CD4 CD25 调节性T细胞和T淋巴细胞亚群的研究

　　【摘要】 目的 观察外周血CD4+CD25+调节性T细胞(Tregs)百分比和T淋巴细胞亚群在慢性乙型肝炎(CHB)患者中的特点。方法 采集CHB患者15例和健康对照20例的外周血单个核细胞(PBMC)标本，应用三色流式分析法对PBMC中CD4+CD25+ Tregs占CD4+百分比及外周血中的T淋巴细胞亚群进行分析。结果 分别比较CD4+CD25highTregs和CD4+CD25+CD127low/-Tregs占CD4+T细胞百分比，两组表型的Tregs在CHB组均高于正常对照组〔(4.25%±3.22%vs1.57%±0.64%)，(4.39%±2.03%vs1.86%±0.84%)〕(P<0.01)。CHB组外周血中的CD4+T淋巴细胞亚群的百分比(32.28%±6.26%)较正常对照组(39.39%±10.73%)下降，统计学有差别(P<0.05)。外周血中CD8+及CD4+/CD8+比值在两组间变化无统计学差异。结论 CHB患者CD4+CD25high和CD4+CD25+CD127low/-Tregs升高，外周血中的CD4+T淋巴细胞百分比下降。

　　【关键词】 肝炎，乙型，慢性;CD4+CD25+调节性T细胞;T淋巴细胞亚群

　　慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染者机体免疫功能紊乱，病毒在体内不能彻底清除，组织损伤迁延不愈。部分患者发展为肝硬化和肝癌，是老年人常见的死因之一。T淋巴细胞是机体抗感染免疫反应中起主导作用的免疫活性细胞，是细胞免疫的主要组成部分。CD4+CD25+调节性T细胞是具有抑制活性的调节性T细胞(Tregs)〔1〕，可能在其发病机制中起关键作用。我们采用流式细胞技术，分别选取了CD4+CD25highTregs，CD4+CD25+CD127low/-Tregs作为本研究中CD4+CD25+Tregs的表面标记，对CHB病人的外周血中的CD4+CD25+ Tregs进行鉴定和分析，并且对慢性乙型肝炎(CHB)患者外周血中的T淋巴细胞亚群变化进行了相关研究。

　　1 对象与方法

　　1.1 研究对象 病例均选自本院2006年3月至2006年11月临床确诊CHB患者，共15例，诊断符合2005年中华医学会肝病学分会、感染病学分会《慢性乙型肝炎防治指南》诊断标准。入选患者在入组前6个月内未经任何抗病毒及免疫抑制剂治疗，并排除其他肝炎病毒感染及合并自身免疫性、酒精性肝病等。另选取20例健康体检人群为对照组，无肝炎病史，乙型肝炎标志物测定均阴性，血清转氨酶和黄疸指数均正常。

　　1.2 主要试剂和仪器 采用美国贝克曼流式细胞仪，三色标记单克隆抗CD25，CD127，CD4 分别与FITC、PE、PerCP5荧光素结合，另选三色标记单克隆抗CD4、CD8、CD3分别与FITC、PE、PerCP荧光素结合，均购自美国CALTAG公司。

　　1.3 流式细胞仪检测CD4+CD25+Tregs和T淋巴细胞亚群 取新鲜采集的枸橼酸钠抗凝血1 ml，Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMC),取大约1×105个细胞加入5 μl下列三组荧光标记抗体：CD25-FITC，CD4-PerCP5，CD127-PE，震荡器混匀，25℃避光孵育30 min，PBS洗涤1次,离心后弃上清，加入少量PBS制成单细胞悬液。分别选择CD4+CD25high(荧光强度>102)和CD4+CD25+CD127low/-T细胞群作为Treg的表型鉴定,分析其占CD4+T细胞百分比。另取40 μl新鲜枸橼酸钠抗凝血，加入3 μl下列3组荧光标记抗体：CD3- PerCP5，CD4- FITC，CD8-PE，震荡器混匀，25℃避光孵育30 min，加入溶血素，PBS洗涤1次,离心后弃上清，加入少量PBS制成单细胞悬液。上机使用CellQuest软件收获细胞并进行分析。

　　1.4 统计学处理 数据以x±s表示，用SPSS10.0软件进行两组间t检验。

　　2 结果

　　2.1 外周血Treg水平 两组Treg细胞占CD4+T淋巴细胞的百分比在CHB患者组均明显高于正常对照组 (P<0.01，表1)。

　　表1 两组外周血中CD4+CD25+Tregs/CD4+T淋巴细胞的百分比及T淋巴细胞亚群的比较(略)

　　与正常对照组比较：1)P<0.01;2)P<0.05

　　2.2 T淋巴细胞亚群的变化 CHB组外周血中的CD4+T淋巴细胞亚群的百分比较正常对照组下降(P<0

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