小鼠GITRL蛋白对Th17细胞的影响及其在小鼠CIA发病中的作用

【关键词】 GITRL; Th17细胞; RORγt; IL-17; 胶原诱导性关节炎; 小鼠

【摘要】 目的:体外原核表达小鼠糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体家族相关配体(glucocorticoid-induced TNFR-related protein ligand,GITRL)蛋白,制备小鼠GITRL(mGITRL)多克隆抗体;体内外研究mGITRL对小鼠Th17细胞产生的影响;建立小鼠胶原诱导性关节炎(collagen-induced arthritis,CIA)模型,观察mGITRL对CIA发病的影响,并寻找其作用机制。方法:(1)取本室留存的mGITRL-pET-32a-E.coli BL-21菌种,涂板,挑取单个菌落接种于LB培养基中,1 mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导蛋白表达,SDS-PAGE电泳检测mGITRL融合蛋白的表达情况。通过ProfinityIMAC Nickel柱分离纯化目的蛋白,纯化蛋白经SDS-PAGE电泳鉴定,并通过内毒素去除试剂盒去除蛋白中的内毒素。将纯化蛋白与弗氏佐剂乳化后免疫家兔,三次免疫后收集兔血清,ELISA法检测兔抗小鼠GITRL抗体效价...更多,Western blot检测抗体特异性。(2)免疫磁珠法分离正常小鼠脾脏来源的CD4+T细胞。将mGITRL蛋白及对照蛋白分别加入小鼠CD4+T细胞的培养体系,在Th17细胞诱导条件下培养96h,通过流式细胞术检测Th17细胞的比例变化;收集细胞培养上清,ELISA法检测上清中细胞因子IL-17表达变化。(3)正常小鼠体内分别注射mGITRL蛋白及对照蛋白,10天后处死小鼠,利用流式细胞术检测小鼠脾脏中Th17细胞的比例变化及其转录因子RORγt的表达情况;ELISA法检测小鼠血清中IL-17表达水平。(4)建立小鼠胶原诱导性关节炎(CIA)模型。尾静脉分别注射mGITRL蛋白及对照蛋白,观察小鼠发病进程(临床评分,CIA发病率,病理学检查);利用流式细胞术检测小鼠脾脏及引流淋巴结中Th17细胞的比例、数目变化及其转录因子RORγt的表达情况;ELISA法检测小鼠血清中IL-17表达水平。结果:(1)携带表达载体mGITRL-pET-32a的E.coli BL-21细菌,经终浓度为1mmol/L IPTG、30℃诱导6h,其融合蛋白分子量大小约为40KD,纯化后目的蛋白纯度＞90%;ELISA法检测兔抗小鼠GITRL抗体效价为1:20000;Western blot检测结果显示该抗体能与mGITRL蛋白特异性结合。(2)免疫磁珠法分离获得小鼠CD4+T细胞,纯度＞95%。在Th17细胞培养体系中,与对照蛋白相比,mGITRL使CD4+IL-17+(Th17)细胞的比例由14.1%上升到16.1%;且随着mGITRL蛋白浓度增加(0.5、1、5、10μg/ml),Th17细胞的比例由15.81%上升为17.90%,细胞培养上清中分泌的细胞因子IL-17由387.51 pg/ml增加到512.70pg/ml。(3)在正常小鼠体内,与注射对照蛋白(CTL组)的小鼠比较,注射mGITRL蛋白(GITRL组)的小鼠脾脏中Th17细胞比例增加极显著(0.86±0.40%vs 1.77±0.49%,p＜0.01);CD4+RORγt+T细胞比例显著性增加(1.21±0.55%vs 1.91±0.60%,p＜0.05);小鼠血清中IL-17含量增高(3.68±1.37 pg/ml vs 6.54±1.32 pg/ml,p＜0.05)。(4)成功建立小鼠CIA模型。在模型鼠中,对照蛋白(CTL-CIA)组小鼠在第一次免疫后第32天发病,第46天病情达到高峰,临床评分达9.1分;目的蛋白(GITRL-CIA)组小鼠,第一次免疫后第28天发病,第38天病情达到高峰,临床评分达10.1分。病理学检查发现,CIA组小鼠及CTL-CIA组小鼠关节中炎症细胞浸润,滑膜增生明显,未见软骨损伤;GITRL-CIA组小鼠关节中除大量浸润的炎症细胞和增生的滑膜外,可见明显血管翳形成和软骨损伤。流式细胞术检测发现,与CIA组小鼠(2.49×105±9.07×104)和CTL-CIA组小鼠(2.07×105±7.01×104)相比,GITRL-CIA组小鼠引流淋巴结中Th17细胞数目显著性增加(2.30×106±9.11×105),结果具有统计学意义(p＜0.05);同时与CIA组小鼠(8.93±3.20 pg/ml)和CTL-CIA组小鼠(8.15±2.56 pg/ml)相比,GITRL-CIA组小

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