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白细胞介素2基因转导对卵巢癌细胞系SKOV3免疫原性的影响 |
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er; Cancer vaccines; Tumor cells, cultured
肿瘤免疫属T淋巴细胞免疫［1］，由于肿瘤相关抗原的抗原性弱、肿瘤细胞组织相容性白细胞抗原(HLA)及共刺激信号B7低表达或不表达，致使肿瘤抗原不能有效递呈，最终导致机体对肿瘤细胞的免疫耐受［2,3］。基因重组技术的不断完善，由分子水平修饰肿瘤细胞的设想成为现实［4］。本研究旨在探讨白细胞介素2 (IL-2）基因转导对卵巢癌细胞免疫原性的影响，及IL-2基因修饰卵巢癌细胞作为肿瘤疫苗的可能性。
材料与方法
一、细胞系
SKOV3为卵巢腺癌细胞系，由北京协和医院妇产科制备。SKOV3/Neo由逆转录病毒介导，将新霉素抗性基因Neo导入SKOV3细胞而建立，具有新霉素抗性［5］。SKOV3/IL-2由逆转录病毒介导，将IL-2基因导入SKOV3细胞而建立，IL-2每24 h分泌量为318 U/106个细胞，具有新霉素抗性［5］。
二、方法
1.细胞HLA分子检测：待测肿瘤细胞共1×106个，分别与鼠抗人HLA-ABC、HLA-DR及HLA-DQ单克隆抗体(购于中国华美公司)稀释液混合、孵育、洗涤，用荧光标记的兔抗鼠IgG标记，2％多聚甲醛固定过夜，第2天应用流式细胞仪检测表达上述3种免疫分子的细胞比例。
2.自然杀伤（NK）细胞的制备：外周血单个核细胞经密度梯度离心法分离后，置于培养瓶中常规培养1 h，去除贴壁的单核细胞，未贴壁细胞用于NK细胞杀伤实验。
3.淋巴细胞与肿瘤细胞混合培养：培养体系为含10％新出生牛血清和5×10-5 mol/L二巯基乙醇的PRIM-1640培养液。取正常成人外周血淋巴细胞，调整细胞浓度为2×106个/ml；待测肿瘤细胞经60Co 50 Gy照射，调整细胞浓度为5×104个/ml；取96孔培养板，每孔加入淋巴细胞悬液、肿瘤细胞悬液各100 μ1，孵育36～48 h，显微镜下观察淋巴细胞生长情况。
4.淋巴因子激活杀伤（LAK）细胞的诱导：培养体系为含10％人AB血清、1 000 μ/ml重组人IL-2（r-h-IL-2）、5×10-5 mol/L 二巯基乙醇、2% 血清白蛋白及5 μ/ml植物血凝素的PRIM-1640培养液。将正常成人外周血淋巴细胞，加入上述培养体系，常规培养5～7 d。
5.淋巴细胞杀伤活性的测定：以SKOV3、SKOV3/Neo和SKOV3/IL-2为靶细胞，应用51Cr对其进行标记；分别以NK和LAK细胞为效应细胞，设3个效靶比，分别为100∶1、50∶1和10∶1，将效应细胞与靶细胞混合(实验组)，同时设加PRMI-1640培养液者为自然释放组，设加6 mol/L盐酸者为最大释放组，γ计数仪测定各孔上清液放射性强度（cpm）。自然释放率和杀伤活性的计算公式如下：
结果
一、SKOV3及其基因修饰细胞HLA分子的表达
SKOV3、SKOV3/Neo和SKOV3/IL-2 3类细胞HLA-ABC、HLA-DR和HLA-DQ分子的表达率见表1。与SKOV3和SKOV3/Neo比较，SKOV3/IL-2细胞HLA-ABC和HLA-DQ分子的表达率均有提高，差异有非常显著性（P<0.001）。
二、SKOV3及其基因修饰细胞对NK细胞杀伤的敏感性
3种靶细胞对NK细胞的杀伤作用均不敏感，差异无显著性（P>0.05），见表2。
表1 SKOV3及其基因修饰细胞HLA分子的表达率(%)
类别 HLA-ABC HLA-DR HLA-DQ
SKOV3 1.5
4.7 2.4
SKOV3/Neo 4.3 2.1 6.9
SKOV3/IL-2 17.7 9.4 19.1
表2 3种靶细胞对不同效靶比NK细胞杀伤的敏感性(%)
类别 100∶1 50∶1 10∶1
SKOV3 6.5 3.4 0.0
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