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胰腺癌组织微卫星DNA不稳定与肿瘤临床特征的相关性研究

更新时间:2012-10-15 14:46:30  
李伟 王殿昌 李卫东 王秀琴 郝希山 战忠利 吴

  DNA中微卫星序列的不稳定(MI) 是发生在多种肿瘤细胞基因组中的分子事件之一[1]。我们选择消化道肿瘤尤其是胰腺癌相关基因附近的多态性位点,以PCR方法扩增肿瘤及非瘤组织细胞基因组中9个位点的微卫星DNA序列,并将电泳结果会同临床和随访资料综合分析,探讨肿瘤组织微卫星DNA不稳定与临床病理指标和疾病预后的关系。
  一、对象与方法
  1.对象:45例标本来自天津肿瘤医院1986~1995年胰腺癌患者存档石蜡标本。男∶女为2.21∶1,年龄37~72岁。胰腺导管腺癌42例,粘液腺癌为3例,胰头癌22例,胰体癌9例,胰尾癌2例,全胰癌12例。组织学高分化16例,中分化5例,低分化24例。45例患者中,4例有恶性肿瘤家族史,18例嗜烟酒。
  2.45例患者中获得完整随访者40例,有5例未随访到。
  3.石蜡组织切片经镜下显微切割分离,提取肿瘤细胞及用于对照的非瘤组织细胞DNA,制备PCR模板[2]。
  4.PCR反应:10 μl PCR 反应体系中加入3中制备的PCR模板2 μl,上、下游引物(research genetics inc. & sagon)各5 pmol/L,10×PCR缓冲液1 μl, 2.5 mmol/LMgCl2 1 μl,50~200 μmol/L 4×dNTPs,0.5U Taq DNA 聚合酶(PE)。经94℃50秒,50~62℃ 60秒,72℃ 60秒反应35个循环,72℃延伸5分钟,4℃保温。结果观察:PCR反应产物与6 μl加样缓冲液混合,变性后上样,经电泳、银染、观察结果。若肿瘤与非瘤组织相比出现等位基因条带的增多和大小的改变等记为MI。出现MI的病例经再次PCR扩增证实。
  5.统计学分析:采用SAS Version 6.02 统计学软件包及POMS Version 2.00 软件包,在VAX及IBM 586/100 计算机上完成,所有统计学数据分析均按α=0.05(双侧)水平进行假设检验,MI 与临床病理学指标的比较分别采用F及F′检验、列联表χ2检验、生存分析等。
  二、结果
  1.胰腺癌组织中的MI:29例标本经检测存在MI(64.4%),6例标本在3个及以上位点存在MI,在2个位点出现MI的有12例,另11例仅在一个位点检测到MI。除此之外,我们观察到MI的发生存在位点特异性(图1),在D18S46(28.6%)、D18S474(22.5%)明显频发,而在D9S176(14.3%)、D3S1234(12.5%)、D3S1481(14.6%)、D7S486(14.3%)和D3S1289(13.2%)位点MI的发生率相差不大,D3S587(10.2%)和D5S365(9.7%)两位点较少发生MI(图2)。
  2.生存分析:我们按MI(-),仅一个位点存在MI[MI(+)*]、2个以上位点存在MI[MI(+)**],将患者生存期分组,并调用SAS软件中的LIFETEST过程,以极限乘法计算生存分布函数,3组患者的50%生存期分别为:MI(-):8.0




图1 部分标本在D3S129、D3S587、D9S176
  位点的MI情况




图2 组织学低分化肿瘤多位点频发MI(6例)

个月;MI(+)*:3.7个月;MI(+)**:2.6个月(χ2=16.95,P<0.05)。
  三、讨论
  频发的遗传改变是肿瘤细胞的特征,新近人们发现微卫星序列在多种肿瘤细胞中存在广泛的遗传不稳定性, MI的产生多被认为与基因组复制过程中的错配修复障碍有关,如在遗传性非息肉性结肠癌(HNPCC)中的MI达86%[3],Han等[4]指出胰腺癌中MI的发生率为67%, 但其仅观察9例患者,缺乏代表性。本组病例MI发生率(64.4%)属较高水平,但9个位点MI频率不尽相同,D18S46和D18S474的MI率超出其它位点一倍多,这种呈位点特异性的非随机化分布方式,为今后临床上对于某一肿瘤选择“敏感”位点进行筛查提供方便。
  虽然胰腺癌的发病有明显的性别差异(男:女为2~4∶1)[5],但本组患者MI的发生没有性别差异(χ2=2.88,P≥0.05

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