新型亚甲基四氢叶酸还原酶单核苷酸多态性研究方法检测恶性血液病易感性

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　　双色荧光杂交微阵列的高通量应用

　　我们利用双色杂交微阵列芯片技术对127例恶性血液病患者和157例健康对照的MTHFR基因的C677T位点进行了分析。两组样本分别点制了4个微阵列，每个微阵列中同一样本重复3个点，病例组点制的微阵列大小为18×22，其中第22行仅有1个样本，对照组点制的微阵列大小为21×23，第23行有3个样本。所有样本PCR产物的点样浓度控制在200-300ng/μl之间。根据Cy3和Cy5双色荧光扫描结果叠加图所呈现的绿、红、黄3种颜色进行分型。同一样本在同一微阵列中有很好的重复性，在不同微阵列中荧光强度略有差别，但叠加图颜色一致，分型结果一致。两组基因型频率均符合Hardy-Wenberg平衡，样本具有群体代表性。病例组的C和T基因频率为58.7%和41.3%，对照组的C和T基因频率为66.9%和33.1%，差异有统计学意义（χ2=4.077,P=0.043）。我们对两组的MTHFRC677T基因型及恶性血液病的易感性进行了单因素分析，677CC、677CT和677TT在患者组和对照组分别为48例（37.8%）、53例（41.7%）、26例（20.5%）和72例（45.9%）、66例（42.0%）、19例（12.1%）。发现677CT和677TT基因型相对677CC基因型发生恶性血液病的风险度有增加趋势，但差异无统计学意义（分别为OR=1.23,95%CI=0.74-2.05,P=0.434和OR=1.97,95%CI=0.98-3.97,P=0.057）。进而我们将患者组4种疾病（CML因例数过少除外）分别与对照组进行了单因素分析，发现677TT基因型发生MM的风险明显增加（OR=4.21,95%CI=1.50-11.83,P=0.006）。677CT和677TT基因型的NHL易感程度有增加的趋势，且677TT较677CT增加明显，呈等位基因计量-效应关系（表1，表2）。相反，677TT基因型的ALL易感程度有下降趋势。Table1.CorrelationbetweenMTHFRC667TandriskofMMandNHL（略）Table2.CorrelationbetweenMTHFRC667TandriskofALLandAML（略）

　　近年来SNP芯片检测备受关注。目前芯片的制作主要有两种方法，一种是将探针固定于芯片，将PCR扩增并标记的待检测目的DNA混合物与探针杂交，这种方法可以检测有限样本的多个SNP位点；另一种方法是将PCR扩增后的待检测目的DNA固定于芯片，以标记的探针进行杂交，这种方法可以检测多个样本的有限SNP位点。Flavell等［2］研制了基于后一种方法的SNP检测芯片，但该方法昂贵的链霉抗生物素蛋白（streptavidin）修饰的玻片只能在PBS中保存3天。我们介绍的双色荧光杂交微阵列方法在等位基因的区分上过程简单、自动化程度高，大样本检测时成本相对低，能在一个实验中分析上千个样品，因此节省了时间和增强了效率。测序法证明，含有13个碱基的荧光标记检测子在37℃的杂交温度下能够精确地进行基因分型。而且该芯片能够较长时间地储存，实验中能够使用较多的微阵列，因此它能对结果的分析提供一个较好的统计基础。叶酸缺乏和（或）叶酸代谢异常可导致多种肿瘤的发生，这与叶酸的两种主要作用有关：①提供甲基使dUMP转变为dTMP，参与DNA的合成；②作为甲基供体维持基因组甲基化的独特模式。MTHFR通过影响叶酸代谢而

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