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局部应用GDNF对运动神经的保护作用研究 |
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下缘1 cm处切断，用9～0无创线缝合神经外膜。于L5、6椎间隙行蛛网膜下腔置管，于手术当天起通过留置管注入GDNF 6 μL(10 μg/mL)，连续注射10 d；b)生理盐水(NS)组18只，同法给予生理盐水6 μL。
1.2 实验标本制备 术后4、8、12周分别处死动物并取材。经左心室插管灌注多聚甲醛固定液后，取腰膨大脊髓(中心为L4～6节段)，－20℃连续冰冻切片，进行尼氏体染色(Thionine硫堇染色法)观察。
1.3 电镜检查 术后12周，将以横断处为中心的包括远近端各约2 cm长的神经取下，去除多余组织，固定于2.5％戊二醛中2 h，缓冲液冲洗，10％锇酸固定后，逐级酒精丙酮酸脱水，环氧树脂浸透包埋，超薄切片机切片，醋酸铀饱和水溶液染色后再用枸橼酸铅染色，JEOL100型透射电镜观察。
1.4 图像分析及数据处理 切片经光镜检查照相及显微图像分析系统分析，计数脊髓前角大、中型运动神经元数目，对髓鞘进行定量测量。检测数据以(±s)表示，采用SPSS软件分析，不同时间点两样本均数比较进行t检验，组内不同时间点比较用SNKq检验。
2 结 果
2.1 坐骨神经功能指数(sciatic function inders，SFI)测定 4周时，两组大鼠的坐骨神经功能指数无统计学差异，8、12周时，GDNF组SFI优于NS组，P＜0.05(见表1)。
2.2 尼氏体染色 本实验计数的神经元为位于脊髓前角外侧细胞核较大的中型神经元。脊髓前角运动神经元的存活率以手术侧与非手术侧同类神经元的数量相比表示，4周后，可见两组神经元的存活率存在显著性差异(见表2)。
2.3 透射电镜观察结果 12周时，GDNF组：可见轴突及髓鞘成熟，髓鞘呈同心圆样排列，胞膜清楚，板层结构清晰，雪旺细胞增生活跃，胞浆内富含线粒体，髓鞘分布较均匀，形态及大小趋于正常。NS组：可见有髓纤维髓鞘薄，厚薄不均匀，髓鞘板层松散，密度不均，排列不规则，轴突直径较细，髓鞘受压变形。
经统计学分析，GDNF组的有髓神经纤维数目，髓鞘厚度和轴突直径均优于NS组，经统计学分析，有显著性差异(P＜0.05)(见表3)。表1 术后各组大鼠SFI变化情况表2 坐骨神经切断后脊髓前角运动神经元存活率的变化情况表3 术后12周神经轴突图象分析结果*注：与NS组比较，*P＜0.05。
3 讨 论
3.1 周围神经损伤后脊髓前角运动神经元的保护策略 周围神经损伤后轴索逆向运输的神经营养因子缺乏是造成神经元病变和死亡的原因之一，提供外源性神经营养因子可以延长神经元的存活时间［3］。有实验表明，切断新生大鼠运动神经，在断端应用一定浓度的GDNF则可阻止神经元的退变、死亡和萎缩［4］，所以神经功能重建的有效治疗方法就是实施神经吻合的同时，对神经元采取保护性措施，使神经元为再生轴突提供基本的物质条件。本实验中SD大鼠的坐骨神经损伤后先通过显微外科技术对神经进行外膜缝合，经椎间隙置管并使其位置固定，再通过留置管向腰膨大神经元的部位给予GDNF，结果表明实验组GDNF的应用有效的保护了脊髓前角运动神经元，且明显提高神经元的存活率。
3.2 GDNF 自1993年首先发现GDNF以来，大量的动物实验表明，GDNF对发育和成熟的运动神经元有神经营养作用，是迄今为止发现的对运动神经元作用最强的神经营养因子。本实验中，实验组应用GDNF后，不同时间点分别与对照组比较，发现运动神经元的数量以及外周神经髓鞘的厚度及直径等指标均优于对照组。提示精细的神经断端缝合加神经元保护较单纯神经断端缝合更有利于神经功能恢复。采用Allen脊髓损伤模型研究表明，脊髓挫伤后GDNFmRNA表达急剧增加，损伤局部给予外源性GDNF能避免和减少脊髓神上一页 [1] [2] [3] [4] 下一页
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