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兔关节软骨细胞转化生长因子－β1免疫组织化学的研究 |
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脑中提取、纯化[3]。
二、方法
（一）免疫组化ABC法：关节软骨细胞经原代培养铺满后，吸除培养液，用质量浓度为0.1mmol/L的胰蛋白酶与质量浓度为0.3mmol/L的EDTA(1∶2)消化1分钟，离心1000转/分；5分钟后收集细胞，以PBS洗涤2次，再以微量PBS重悬细胞后，做细胞涂片；用4％多聚甲醛固定20分钟，PBS洗3次，每次3分钟，吹干后加血清，10分钟。加一抗微波处理50秒，放置10分钟，再用PBS洗3次，每次3分钟；二抗微波处理50秒，放置5分钟，PBS洗3次，每次3分钟，HRP标记卵白素微波处理50秒，放置5分钟。DAB30ml＋质量浓度为0.17mmol/L的双氧水50μl显色10分钟，蒸馏水稍洗后，用苏木素衬染1分钟，脱水，透明，封片，镜检。
（二）SPA－胶金标记免疫电镜研究[4]：同上收集关节软骨细胞，PBS漂洗后用1.25％戊二醛微波固定5～20秒。漂洗后用TGF－β1抗体振荡孵育60分钟，35℃;PBS漂洗后用SPA－胶金振荡孵育60分钟，35℃;PBS洗后再用2％戊二醛固定30～60分钟，即可用血浆将标本凝成块状。上述标本在凝成块状之前均离心，凝成块状后按常规电镜标本制备方法，Epon812包埋，超薄切片用醛酸铀、枸橼酸铅染色后即可在电镜下观察。
结果
一、将FGF100ng/ml换液时加入细胞培养液，每培养48小时换液一次。免疫组化研究显示细胞明显呈棕色，而对照组则棕色不明显或呈阴性（图1，2）。
图1 用FGF 100ng/ml作用于培养细胞,免疫组织化学ABC法显
示实验组细胞呈明显棕色 ABC法染色×3.3×100×2.5
图2 对照组细胞棕色不明显ABC 法染色×3.3×100×2.5
二、将FGF100ng/ml换液时加入细胞培养液，免疫电镜研究显示细胞膜外表面有明显胶金颗粒粘附，而对照组则较少（图3，4）。
图3 用FGF100ng/ml作用于培养细胞，SPA－胶金
标记免疫电镜组织化学显示实验组细胞膜表面
有明显的胶金颗粒粘附60000×2.5
图4 对照组细胞膜表面胶金颗粒很少60000×2.5
讨论
一、本研究将FGF用于培养兔关节软骨细胞，作链霉素－亲和素放大系统ABC免疫组化研究，结果显示实验组细胞明显呈棕色，而对照组棕色不明显或为阴性。同时，我们用免疫胶体金标记组化方法，进一步明确软骨细胞TGF－β的定位。免疫金标记技术较免疫荧光、免疫酶标等技术有更大的优越性，它能在超微结构水平上精确、细致地定位，特异性强，因此在一些研究工作和某些疾病的鉴别诊断中越来越受到重视。在免疫染色时，我们还结合微波固定，使固定液在极短的时间内穿透到标本内部，使微细结构保存良好，同时由于固定时间短，从而减少固定液对抗原的破坏作用，故标记物阳性率高。本研究结果显示FGF作用于培养兔关节软骨细胞后，细胞膜表面的绒毛上有明显的胶金标记，而对照组则很少。从上述免疫组化研究可见，FGF能促进兔关节软骨细胞TGF－β的合成。
二、研究认为，FGF是关节软骨细胞最明显的有丝分裂刺激源和形态源之一[5]。它对中胚层来源的细胞包括软骨细胞具有明显的促有丝分裂作用。在骨的基质中存在大量FGF，Kato经放射性受体测定，在兔生长骺软骨中每毫克骨蛋白中含FGF约45～280ng，且有一部分是有活性的。Lobb等[6]从软骨组织中检测到FGF基因，提示软骨细胞能自分泌FGF。这些研究表明FGF在软骨的生长、发育、分化、骨化过程中有重要的调节作用。对培养的软骨细胞，当局部不加FGF时，关节软骨细胞迅速表现为透明、肥大、钙化，或分化成为成纤维细胞，失去软骨表型，合成硫酸软骨素、Ⅱ型胶原的能力大大降低。而加入FGF后，能保持软骨表现型，并且在细胞生长融合时，软骨细胞被基质包围，如同体内软骨组织一样。Kato等认为，当软骨细胞生长、分裂活跃时，只有存在FGF，才能保存和维持软骨细胞表型，甚至将一些已成熟或转化为成纤维细胞的细胞反分化为软骨细胞。Sachs等[7]观察到，即使细胞培养过程中不加高浓度的血清，也可见到上一页 [1] [2] [3] 下一页
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