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白介素 |
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osis，OA）发病及进展过程中，细胞因子白介素-1(IL-1)，IL-6、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等均起着重要作用。尽管目前尚不能确定它们是OA的发病因素，还是其病变过程中的产物，但细胞因子水平与骨关节病病变程度有着密切联系［1，2］。糖皮质激素是临床上常用的骨关节病治疗药物，但其治疗价值存在争议。二者对关节软骨的确切作用目前尚不清楚。笔者利用体外细胞培养、同位素掺入及狭缝杂交方法，研究IL-1及地塞米松对人髁状突软骨(MCC)细胞增殖、代谢的影响及对几种重要的间质型胶原即Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原表达的调控作用，以期为骨关节病、软骨损伤的发病机制的研究，以及临床合理应用激素治疗OA与关节损伤提供理论和实验依据。
材料与方法
一、人胚髁状突软骨细胞分离培养
参照文献［3］，髁状突软骨取自因健康原因而终止妊娠的4～6个月龄水囊引产的人胚胎。经机械分离及胰蛋白酶、胶原酶联合消化获得，接种于DMEM培养基，内含体积分数为10%的小牛血清，常规条件下培养。
二、IL-1及地塞米松对人髁状突软骨细胞增殖及胶原蛋白合成的影响
取对数生长期的第2代人髁状突软骨细胞，调整细胞浓度为1×105/ml，定量接种于96孔板。待细胞贴壁后，更换为无血清DMEM培养基培养24 h，使细胞相对同步化。然后更换含IL-1（0.1，1，10，100 ng/ml）或地塞米松（0.1，1，10，100 μg/ml）的培养基，同时各样品孔加入 3 H-TdR或 3 H-proline(终浓度为185 kBq/ml)继续培养至预定时间，多头细胞收集器将细胞抽滤、点样于“49型”玻璃纤维滤纸。液体闪烁谱仪测定各样品的min-1值。
三、IL-1及地塞米松对人髁状突软骨细胞Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ前胶原基因表达的影响
取培养的第2代软骨细胞，以1×105/ml密度接种于T125 ml培养瓶。待细胞长满汇合成单层时(约为2×106)，更换培养基，分别加入不同的实验因素，继续培养24 h。实验分组为：空白对照组、IL-1(10 ng/ml)组、地塞米松(100 μg/ml)组，每3瓶细胞为一组。
1. 人髁状突软骨细胞RNA的提取、鉴定：采用RNeasy 试剂盒提取细胞总RNA。紫外分光光度计A260/A280，确定RNA的纯度和含量，大于1.8表明纯度较好。经甲醛变性凝胶电泳鉴定，28S及18S条带清晰，所获RNA具较好完整性。
2. Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型前胶原cDNA探针的提取、标记：各型重组质粒经转化、鉴定，大量扩增，碱裂解法抽提，限制性酶切消化后，低熔点琼脂糖凝胶电泳回收特定cDNA片段。探针标记按地高辛标记试剂盒说明进行。
3. 狭缝杂交及密度扫描：取适当大小的尼龙膜，取各样本RNA，依次等倍稀释，即4，2，1 μg，上样抽滤。置120℃真空烤箱内30 min，使样品RNA与尼龙膜发生交联。将点样的尼龙膜放入塑料袋中，加入预杂交液4 ml，50℃水浴保温2 h。更换杂交液（含50 pg/ml已变性的特定cDNA探针），50℃恒温杂交过夜。杂交后，以2×SSC，质量浓度为1 g/L的 SDS；0.1×SSC，质量浓度为1 g/L的SDS依次洗膜。在抗地高辛抗体 (150 mU/ml)溶液中孵育30 min，将杂交膜转移至3 ml显色液中，暗室内室温孵育16 h。用马来酸缓冲液终止反应。干燥后，进行灰度扫描。
四、统计学处理：实验结果均以±s表示，采用t检验确定组间差异。
结 果
一、IL-1及地塞米松对人MCC细胞增殖及代谢的作用
IL-1在0.1～100 ng/ml浓度范围内呈剂量效应关系地抑制MCC增殖及胶原合成。地塞米松在1～100 μg/ml浓度范围内，一方面可促进细胞增殖，另一方面却抑制其胶原蛋白合成。结果详见表1。
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