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用量热法研究水稻线粒体不同条件下的能量释放 |
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rice mitochondria under different conditions.
Key words: rice (Oryza sativa L.), mitochondria, energy liberation, calorimetry, thermodynamics, kinetics
线粒体是真核细胞中一种具半自主性的重要细胞器，有自身独特的遗传系统。它从细胞内分离出来后，其酶系统仍具活性，且其体内也有一定的营养物质，在一定条件下线粒体仍可以进行某种程度的代谢，从而会释放出一定的能量。用精密微热量计可检测其释放出的能量，从而获得其能量释放热谱。在不同条件下，线粒体的能量释放会呈现不同的规律和特性，探讨这些规律和特性对了解线粒体功能和代谢机制以及疾病、衰老和植物抗逆性等都有重要的意义(杨福愉1994)。用量热法研究动物组织线粒体的能量释放已有一些报告(Wang 等1991，Xie等1993， Tan等1996)，但极少有高等植物线粒体能量释放的量热及其热力学和动力学研究的报告。本文分别用精密微热量计和差示扫描量热(differential scanning calorimetry, DSC)仪测定了广丛41B水稻线粒体体外能量释放热谱和DSC曲线，探讨了水稻线粒体在恒温和变温条件下能量释放规律及其热力学和动力学特性。
1 材料与方法
1.1 材料培养 实验用广丛41B(简称GB)籼型水稻(Oryza sativa L.)种子由武汉大学生命科学学院遗传学研究所提供。种子经15%次氯酸钠溶液浸泡表面消毒10min，然后用无菌水冲冼干净。去除水面的空瘪粒后，于25℃浸种两昼夜。在干净的白瓷盘中铺3层滤纸，并注入无菌水使滤纸充分浸透，播上种子并加盖。在25℃恒温培养箱中避光发芽长苗8～10d,收获黄化苗用15%次氯酸钠表面灭菌，蒸馏水洗涤2～3次，再用无菌水洗涤1～2次，置-70 ℃保存待用或立即使用。
1.2 水稻线粒体的提取制备 参照杨金水和Walbot(1993)的方法提取制备供试水稻线粒体。
1.3 水稻线粒体恒温下能量释放热谱测定 用瑞典LKB-Produkter AB公司产LKB-2277生物活性检测系统测量恒温下线粒体能量释放热谱。具体操作见文献(Wang等1991，Suurkuusk和Wads 1982)。实验中选用2个无菌密封安瓿，一个内装保存介质(Na2EDTA lmmol／L， Tris-HCl 10mmol／L,pH 8.0)1ml和空气2ml作为参比,另一个内装1ml线粒体悬浮液(0.3g线粒体+保存介质)和2ml空气。线粒体在实验测定前置0～3℃下约15h和40d。实验测定温度为25 和30℃。选择仪器测量档为100μW。实验保证在无菌条件下进行。
1.4 水稻线粒体变温下能量释放DSC曲线测定 经分离纯化后的水稻线粒体悬浮于250μl保存介质中置0～3℃下待测。用美国Dupont Instrument公司产Dupont-910差示扫描量热仪及9900热分析计算机系统测定水稻线粒体变温下能量释放热谱。实验测定时均采用该仪器专用于液体测量的密封铝制钳锅，经仔细灭菌后装入待测样品，并用该仪器配套专用密封压盖机压盖密封。将装好样品并密封称重后的坩锅放入仪器测量池中，用该仪器专用特制冰筒冷却至0℃以下开始升温。升温速率为3K／min。待温度达80℃时停止升温。保护气(N2)流速为40ml／min。空铝制密封坩锅作参比。用高纯铟标定仪器所测温度和能量变化值。实验保证在无菌条件下进行。
2 结 果
2.1 水稻线粒体恒温下能量释放热谱及其热力学
实验测定的水稻线粒体恒温下能量释放热谱分别示于图1、2。线粒体在离体条件下在一段时期内其代谢仍可进行。由于在其保存介质中未加入线粒体所需营养成份，因而其代谢只是一种利用自身营养物的消耗代谢。本实验所测得的则是线粒体在此代谢过程中以热的形式释放出来的能量，因此实验所测曲线即为线粒体能量释放热谱。
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