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甲基汞对大脑皮层神经细胞内游离钙的影响 |
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），DMEM培养基和胎牛血清（Gibco、BRL），其他试剂均为国产分析纯。RF 2000型荧光分光光度计（日本岛津）501型超级恒温水浴器（上海试验仪器厂），LDZ-5-2离心机。
2．测定原理：Fura-2因亲水性较强难以进入细胞，在其负性基团部位结合上亲脂的乙酰羟甲基酯成为Fura-2/AM后与细胞温育时很容易透过细胞膜。Fura-2/AM进入细胞后，在胞内酯酶作用下水解成Fura-2而滞留在胞浆内，后者与胞浆内游离Ca2+结合形成Fura-2-Ca2+复合物。Fura-2及其与Ca2+结合的复合物的最大激发光波长分别为380 nm和340 nm，其发射光的强度与Ca2+浓度呈比例关系。据此可由公式计算出胞内游离Ca2+浓度=Kd（F0Fs）（R-Rmin）/（Rmax-R），式中Kd值为224 nmol/L，F0和Fs分别代表Ca2+为零及饱和状态下测得的荧光强度，R为实验观察到的荧光比值，Rmax和Rmin分别为最大和最小的荧光比值，即在＞1 mmol/L游离Ca2+浓度和大于等于此Ca2+浓度2倍的乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸(EGTA)情况下，分别加入0.1% Triton X-100后所测定的荧光比值，在计算游离Ca2+之前，应减去在没有负载Fura-2的细胞中测得的自发荧光和背景荧光。
3．单细胞悬液制备：参照文献［3］的方法，取新生SD大鼠，剥离出脑组织，迅速分离出大脑皮层。在冷Hank液（NaCl 137 mmol/L、KCl 5.0 mmol/L、CaCl2 1.3 mmol/L、MgSO4 0.8 mmol/L、Na2HPO4 0.6 mmol/L、KH2PO4 0.4 mmol/L、NaHCO3 3.0 mmol/L、右旋葡萄糖5.6 mmol/L、pH值7.4）中清洗2次，仔细剥离、剔除软脑膜和血管，再用Hank液洗2次。把脑组织置于小烧杯中，用剪刀剪至1 mm3大小，加入预温的0.25%胰蛋白酶37℃消化20 min，消化结束后用含10%胎牛血清的DMEM培养基终止消化。过250目筛，滤液经1 500 r/min离心10 min，再用Hank液洗2次。最后用含10%胎牛血清的DMEM培养基制成单细胞悬液，计数并调整细胞密度为1×108/ml，用锥虫蓝染色检查细胞存活率，要求不低于95%。
4．Fura-2/ AM 负载：在上述单细胞悬液中，加入Fura-2/AM应用液，使终浓度为5 μmol/L。37℃恒温水浴振荡45 min，负载后细胞悬液1 000 r/min离心5 min，弃上清，再用含0.2%牛血清白蛋白的Hank液洗2次。最后用无镁的Hepes-Hank缓冲液（Hepes 10 mmol/L，KCl 5.0 mmol/L，NaCl 145 mmol/L，CaCl2 1.3 mmol/L，右旋葡萄糖10 mmol/L，Na2HPO4 1 mmol/L，pH值7.4）悬浮细胞，调整细胞密度为1×106/ml，锥虫蓝染色检查细胞存活率，要求不低于90%。测定前细胞37℃预温3 min。
5．荧光测定：激发光光栅和发射光光栅均为10 nm，激发波长为340 nm和380 nm交替扫描，激发光波长变换时间1 s，发射光波长为510 nm。测定时先分别测定340 nm和380 nm激发光所产生的荧光强度，求出R值，再加入终浓度为0.1%的Triton X-100进行测定，求出Rmax值，最后加入5 mmol/L EGTA（pH>8.5）进行测定，求出Rmin值，再根据前述公式计算游离Ca2+。
6．处理因素：研究甲基汞对胞内游离Ca2+影响时，于负载好的细胞悬液内，加入甲基汞使其终浓度分别为0.00、0.01、0.10、1.00、2.00、5.00 μmol/L，37℃恒温水浴10 min，再进行测定；研究甲基汞影响胞内游离Ca2+的机理时，先在负载好的细胞悬液内，分别加入终浓度为AP510 μmol/L，memantine 100 μmol/L，verapamil 10 μmol/L，TTX 5 μmol/L，37℃恒温水浴10 min，再加入终浓度为2 μmol/L的甲基汞，37℃恒温水浴10 min后进行测定；研究在无胞外Ca2+条件下，甲基汞对胞内游离Ca2+的影响时，用不含Ca2+、含EGTA 5 mmol/L的Hepes-Hank液代替含CaCl2 1.3 mmol/L的Hepes-Hank液，其他操作条件不变。所有的负载细胞在各种处理完成后10 min内测完。
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