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禁食对大鼠肝脏胰岛素样生长因子 |
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肝IGF-Ⅰ和IGFBP-1基因表达的影响，以及对肝白蛋白基因表达的影响。
材料与方法
1.材料：异硫氰酸胍，巯基乙醇，十二烷基硫酸钠，琼脂糖等(Sigma公司产品)。大鼠IGF-Ⅰ cDNA（法国巴黎大学Bouc博士馈赠）、IGFBP-1 cDNA（巴黎圣.安托尼医院Babajko博士馈赠）、白蛋白cDNA（美国费城癌症研究中心Kioussis博士馈赠）、18SrRNA寡核苷酸（巴黎Robert Debre医院 Asfari博士馈赠）。
2.方法：雄性Wistar大鼠, 体重336～362 g(354.5 g±7.4 g)，9周龄。自由饮水, 光照与黑暗各12小时。分为4组, 每组6只动物。禁食时间分别为0、14、24、48小时。试验结束时称体重，取尾血测定血糖, 处死大鼠获取少许肝叶组织置液氮中速冻,标本保存于-80℃备用。
采用异硫氰酸胍-酸-氯仿一步法提取总RNA［3］。所得RNA标本，经琼脂糖电泳证实其完整性，吸光度260 nm/280 nm比色定量及鉴定纯度。各取40 μg总RNA点样于1%琼脂糖凝胶中行甲醛变性电泳5～6小时，利用毛细管法转移至尼龙膜，小剂量紫外线照射固定核酸分子，干燥保存待杂交。
采用随机引物法试剂盒标记cDNA探针(Amersham公司）。Sephadex-G50柱纯化探针。杂交缓冲液为0.2 mol/L磷酸缓冲液，内含7%十二烷基硫酸钠，1%牛血清白蛋白和1 mmol/L EDTA。65℃杂交16～24小时。洗膜后，放射性自动成像仪(instant imager,USA)测定杂交信号强度（单位cpm），随后进行放射自显影，曝光3～5天。尼龙膜经去杂交处理后可再次杂交。
mRNA含量以各mRNA杂交信号强度(cpm)占相应18 S rRNA杂交信号强度(cpm)的百分比表示(%)，以便更好地避免误差［4］。数据表示为±s。统计学分析采用多样本方差分析。
结果
禁食前后大鼠体重和血糖变化如表1所示。可见，禁食后大鼠体重和血糖均明显降低。禁食48小时后体重下降11.8%，血糖下降50.8%。
表1 禁食对大鼠体重和血糖的影响
禁食前 禁食后(h)
14 24 48
体重(g) 356.0±5.3 329.3±9.0* 325.3±3.1 314.0±2.0
血糖(mmol/L) 4.43±0.42 3.39±0.78* 2.85±0.15 2.18±0.28
*与禁食前比较P<0.001
对大鼠肝脏RNA进行Northern印迹分析，显示IGF-Ⅰ mRNA存在多种形式，即7.5 kb、1.7 kb、0.9～1.2 kb, 尤以0.9～1.2 kb区带最为显著。由于7.5 kb和1.7 kb放射性强度太弱，不能有效进行定量测定，因此IGF-Ⅰ mRNA水平以其0.9～1.2 kb变化为代表。IGFBP-1和白蛋白mRNA分别为1.8 kb和2.1 kb的单一片段。经18 S rRNA纠正后，mRNA含量如表2所示。可见，禁食24小时后IGF-Ⅰ mRNA含量开始下降，但差异未达到显著性。禁食后48小时，IGF-Ⅰ mRNA含量明显低于禁食前，下降幅度为32.7%(P<0.05)。与IGF-Ⅰ mRNA的变化相反，IGFBP-1 mRNA于禁食后逐渐上升，在禁食后24小时达到高峰，是禁食前的2.5倍(P<0.05)。禁食后48小时, IGFBP-1 mRNA稍有下降，但仍高于正常对照(P<0.05)。禁食后肝白蛋白mRNA含量无明显变化(P>0.05)。
表2 禁食前后大鼠肝IGF-Ⅰ和IGFBP-1 mRNA变化
禁食前 禁食后(h)
14 24 48
IGF-Ⅰ 55.6±8.2
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