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用简并寡核苷酸引物构建人类染色体区带特异性探针池的技术 |
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s of 30 positive clones. The rate of single-copy and low-repeated sequences was about 81%(178/220), while the rate of middle-repeated and high-repeated sequences was about 19%(42/220).Conclusion The results proved that the modified microdissection combining DOP-PCR technique provided a simple and efficient method to construct the human chromosome band-specific probe pools and might contribute to gene cloning and complete sequencing of human genome.
【Key words】 Microdissection Chromosomal band Degenerate oligonucleotide primed-polymerase chain reaction Probe pool
分子遗传学及人类基因组计划的发展要求染色体特异性、染色体区带特异性探针池的构建，它有助于分子水平的疾病诊断、人类基因组全序列分析及致病基
因的分离。本室1989年由邓汉湘等［1］建立了显微切割、DNA提取、人工引物接头、PCR及微克隆技术，构建了24个人类染色体特异性和42个染色体区带特异性探针池［2，3］，但该法操作较繁锁，成功率不高，我们报道一种在本室工作基础上改进的技术，将显微切割与简并寡核苷酸引物-PCR(degenerate oligonucleotide primed PCR, DOP-PCR)结合构建了3p23-p26，3q21-q22，4p12-p16 3个区带特异性探针池，同时建立了3q21-q22区带特异性DNA文库。
1 材料与方法
1.1 染色体制备及切割 取正常男性外周血淋巴细胞按我室常规制备染色体标本［4］，定点切割30个3p23-p26、28个3q21-q22、25个4p12-p16 DNA片段，并将DNA片段转移到含20μl无菌水的eppendorf管中。
1.2 DOP-PCR反应 每管加入以下试剂，使总体积为100μl，终浓度为Taq多聚酶0.025U／μl；引物(5′-CCGACTCGAGNNNNNNATGTGG-3′)2μmol／L
MgCl2；dNTP各0.1mmol/L；KCl25mmol/L；MgCl2 0.75mmol/L，Tris-HCl 5mmol/L,pH8.3;0.0025%(V/V)brij 35。同时设空白及阳性对照，阳性对照加4pg gDNA。按以下程序热循环扩增。
1.3 荧光原位杂交 按我室方法［5］常规制片，Biotin-16-dUTP PCR标记，杂交，PI染色，观察并照相。
1.4 微克隆及鉴定
1.4.1 取3q21-q22探针池，用苯酚、氯仿灭活Taq多聚酶后，乙醇沉淀PCR产物并溶于TE中，将PCR产物用XhoⅠ消化后与经SalⅠ消化去磷酸化的pUC19连接起来，转染大肠杆菌DH5α，并接种含氨苄青霉素、异丙基-β-D-代半乳糖苷(IPTG)和5-溴-4氯-3吲哚-β-D半乳糖苷(X-gal)的琼脂培养皿上，37℃培养18～24小时，挑30个白色菌落，用含氨苄青霉素的LB培养基培养后抽提质粒，EcoRⅠ和HindⅢ消化，1.5%琼脂糖凝胶电泳。
1.4.2 挑取220个白色克隆点于铺在LB固体培养基平皿上的尼龙膜上，37℃培养6小时，变性，中和、烤膜，预杂交，然后与α-32P ATP标记的gDNA杂交，放射自显影。
2 结果
利用染色体显微切割技术切割人类染色体3p23-p26，3q21-q22，4p12-p16区带各约2pgDNA，95℃ 5分钟直接释放DNA， DOP-PCR扩增到1～2μg，电泳检测表明扩增片段大小约300～1800bp(图1)，经荧光原位杂交检测，均在所切割相应区带出现特异性黄绿色荧光信号，证实来自所切割相应区带(图2)，将XhoⅠ消化的3q21-q22 上一页 [1] [2] [3] 下一页
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