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昆明山海棠诱导人白血病细胞HPRT基因突变的研究 |
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效应而引起人们的关注［1］。有资料表明THH有明显的细胞分裂抑制效应、非整倍体毒性和可能的染色体损伤作用［2,3］，最近我室还发现THH对肿瘤细胞具有很强的诱导凋亡作用，但关于THH在基因水平上的影响作用还很少报道［4］。HPRT基因作为一个内源性结构基因，编码产生嘌呤代谢补充途径的关键酶，由于其本身具有的一些独特性质，如定位于X性染色体上，为非必需基因，对于突变型与野生型细胞株均可鉴定，以及自发突变率低等，HPRT基因目前最有希望成为突变与癌变研究的主要分子标记物之一。因此，本实验采用人白血病HL－60细胞作为观察对象，研究THH对HPRT基因的致突变作用，为探讨THH的遗传毒性以及潜在的抗肿瘤作用的机理提供一定的材料与信息。
1 材料与方法
1.1 昆明山海棠水提取液的制备
THH购自昆明市中药材公司。制备时称取20g THH粉碎物，以400 ml去离子水浸泡过夜，文火煮沸3次，过滤去渣，浓缩至30 ml，离心去除沉淀，上清液过滤除菌，浓缩的水提取液以067 g生药/ml计，4℃保存。
1.2 细胞培养与筛选
HL－60细胞属人急性早幼粒白血病细胞株，细胞核型46(43～48)，倍增时间12～16 h。为了降低细胞HPRT位点自发突变频率，实验前用1％HAT选择培养基(内含次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷)处理24 h。
1.3 细胞毒性与突变频率的测定
细胞接种存活率、克隆效率和突变频率的测定方法参见文献［5］。
1.4 突变细胞的筛选，扩增与DNA提取
从阳性微孔中把明确的单个克隆对应地转入含有2μg/ml 6－TG筛选培养液的24孔培养板中初次扩增。然后以103个细胞/孔浓度分别接种于含HAT选择培养基的培养板中，只有细胞出现明显死亡者才认为是突变克隆细胞，其余细胞转入培养瓶中再次扩增。最后以常规方法分离提取细胞DNA。
1.5 PCR引物的设计、合成与鉴定
引物序列参考了已报道的研究资料［6］，并运用计算机设计HPRT基因9个外显子相对应的8对引物。引物合成与鉴定由北京贝克曼示范实验室，美国赛百盛公司和中科院上海细胞生物所共同完成。
1.6 DNA多重PCR反应与电泳分析
取上面提取的细胞DNA 0.5～2.0μl，大约36～50 ng，加入50 pmol引物，50μl反应液中含50 mmol/L KCl，10 mmol/L TrisHCL(pH88)，0.3～105 mmol/L MgCl2，0.2 mmol/L dNTPs，2.5U TaqDNA聚合酶。多重PCR反应条件是98℃预变性7 min后，94℃ 1.5min，52℃ 1.5min，72℃ 2.0min，循环40次；外显子1扩增条件是98℃预变性7 min后，95℃ 0.5min，64℃ 1.0min，72℃ 1.0min，循环30次。最后一个PCR循环完成后，继续在72℃温度上延伸5 min。扩增完成后，取10μl反应液在3％琼脂糖凝胶中电泳。
2 结果与讨论
2.1 THH对HL－60细胞的毒性及致突变性的测定
随着THH染毒剂量的增大，细胞死亡数量相应地增加，细胞接种存活率逐渐下降；同时，细胞发生突变的数目相应地增多，HPRT基因突变频率明显升高。HPRT基因突变频率在10～60μl/2ml剂量间呈明显的剂量－反应关系，但当剂量增至100μl/2ml时，因细胞毒性太大，接种存活率降至6.5％而不能培养形成克隆，所以无法统计突变频率(表1)。本实验的研究结果表明，THH有明显的细胞毒性，并能诱导HL－60细胞发生HPRT基因突变，但对细胞本身的克隆能力无明显的影响。
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