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牙髓牙本质复合体纤维粘连蛋白的免疫组织化学研究与定量分析 |
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in limitation of diffusion of pulpitis.
【Key words】 Human premolars; Dental pulp-dentin complex; Fibronectin; Immunohistochemistry; Quantitative image analysis
纤维粘连蛋白(fibronectin,FN)是细胞外间质的重要成分，在细胞粘连、迁移、组织损伤后修复和肿瘤的浸润、转移中发挥了重要作用。80年代以来，许多学者研究了纤维粘连蛋白在牙髓牙本质复合体中的分布，但在前期牙本质和成熟牙本质中是否存在纤维粘连蛋白，至今还有争论，其定量分析更为鲜见。牙髓牙本质复合体是牙组织中唯一具有生物活性的结构，弄清楚它的纤维粘连蛋白分布，有利于了解牙组织内各结构的位置关系，也有利于认识牙病发生，发展的结构基础，因此我们对牙髓牙本质复合体纤维粘连蛋白的表达、表达部位及其定量进行了研究。
材料和方法
1.样品收集、包埋、切片
收集正畸或修复拔出的健康人前磨牙60颗，年龄11～45岁，男女各半，无疾病和龋齿史。拔下的牙迅速截去根尖1/3，用4%多聚甲醛液固定24h，于4mol/L甲酸～0.5mol/L甲酸钠液中脱钙2～4周，石蜡包埋，切片5μm。
2.SP法免疫组织化学
切片脱蜡入水，滴加复合消化酶(博士德公司提供)，10min；3%过氧化氢10min；正常羊血清，10min；兔抗人纤维粘连蛋白多克隆抗体(Sigma公司产品，工作浓度1∶200)，60min；羊抗兔生物素标记的第二抗体(美国Matrix公司产品)，20min；链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶液(美国Matrix公司产品)，20min，以上每步均在37℃下进行，各步之间用PBS液清洗。然后滴加DAB及H2O2底物液，在显微镜下控制显色。自来水冲洗，苏木精复染，中性树胶封片。对照片用PBS代替兔抗人纤维粘连蛋白多克隆抗体，其他步骤同上。阴性为浅黄色或无色，阳性为棕黄色。
3.图像定量分析与统计学处理
免疫组织化学切片输入MPIAS-500多媒体彩色病理分析系统，在0.199μm象素点长，1.109×104μm2测量窗下进行定量分析。在冠部牙髓中央区，周围区，前期牙本质，近髓1/3成熟牙本质，中1/3成熟牙本质，近釉1/3成熟牙本质各取5个视野，每个视野框取10个小窗口进行纤维粘连蛋白-IR体密度和线密度的测定，同时在每个视野中各选10个IR阳性点进行积分光密度的测定。
所得数据输入计算机，用SAS软件进行t检验的统计学分析。
结果和讨论
1.纤维粘连蛋白-IR物在牙髓牙本质复合体内的分布
在牙髓中央区，纤维粘连蛋白-IR以条索状和网状两种形式存在，条索状者一般纤维粗大，数量少，多局限于中轴部分，沿血管和神经分布，动脉周围多于静脉。网状者一般较条索状纤维细小，数量多，广泛存在于中轴以外的基质中。从中轴向周边，纤维由粗变细，和致密(图1)。在多细胞区纤维粘连蛋白-IR物略为增粗，呈细条索网，经成纤维细胞之间至乏细胞区。在乏细胞区纤维粘连蛋白-IR物更为细小，无方向性，彼此交织成网，并向成牙本质细胞层延伸。在成牙本质细胞层，纤维粘连蛋白-IR物汇集成束，经成牙本质细胞之间到达前期牙本质(图2)。前期牙本质内的纤维粘连蛋白-IR物尤为丰富，纤维粗大密集，着色深；在成熟牙本质内，纤维粘连蛋白-IR物仅见于牙本质小管与成牙本质细胞突起之间的间隙内，通过小管侧支与相邻牙本质小管内的纤维粘连蛋白-IR物相连。其他成熟牙本质内未见纤维粘连蛋白阳性反应(图3)。用PBS液代替一抗的对照片中未见纤维粘连蛋白的阳性反应物。
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