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不同功能状态精子表面复型的透射电镜观察 |
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1. 精子的实验处理
手淫法采集正常人精液，待其液化后以上游技术［2］分离活精子，分离用培养液采用BWW(配方见参考文献［2］)；精子悬液分别进行下述处理：(1)不经任何处理直接制样(正常组)；(2)用BWW调节精子密度为5～10×106/ml,37℃培养6h进行体外获能(获能组)；(3)体外获能后加入Ca2+载体A 23187(Sigma,C 7522) 5μmol/L,37℃继续培养30min诱导顶体反应(AR组)；(4)用含枸橼酸钠0.74%，果糖1.35%的低渗溶液于37℃水浴中培养30min，进行低渗膨胀试验(HOS组)，方法见参考文献［3］。
2. 细胞悬液制备
各组精子悬液以500×g离心5min，弃上清，精子沉淀用PBS悬浮，离心洗涤，用适量PBS再悬浮精子，加入等体积的2.5%戊二醛/PBS混匀，室温固定30min(或4℃过夜)；离心弃戊二醛，并用PBS洗涤2遍，调节精子浓度为约20×106/ml备用。
3. 阳离子膜玻片制备
取洁净的盖玻片浸入100%酒精5min以上，取出晾干，浸入0.05%～0.1%多聚-L-赖氨酸(poly-L-Lysine,PLL;Sigma)水溶液5min或将PLL滴于盖玻片上并静置于湿盒中5min；取出盖玻片并用双蒸水冲洗除去残余PLL，以便PLL在盖玻片上形成单层阳离子膜，立即用于细胞贴片或晾干贮存于-20℃中备用。
4. 单层细胞贴片制备
将经PBS洗涤过的精子悬液适量滴于阳离子膜玻片上，倾斜玻片使液滴扩展至所需面积，湿盒内静置10min，光镜下监控至细胞贴附于玻片上；用PBS冲洗玻片以除去残余细胞；双蒸水冲洗细胞贴片。
5. 细胞脱水与干燥
按叔丁醇冷却干燥法［4］改良：细胞贴片用系列酒精脱水：60%→70%→80%→90%→95%→100%→100%，各浸泡5min；转入100%酒精与100%叔丁醇(tert-butylalcohol,TBA,上海试剂一厂)等量混合液浸泡5min，100% TBA浸透5min，2次；取出贴片平放于玻璃平皿内置的青霉素瓶塞上，速加一大滴TBA，转入4℃冰箱放置10～15min使TBA冷却结晶；移入玻璃真空干燥器内，抽气45～60min，至玻片上结晶升华完毕，停止抽气并关闭干燥器通气口；待干燥器复温后取出玻片，干燥处保存待复型。
6. 铂碳喷镀复型制备
将细胞贴片置于真空喷镀仪(Hitachi, HUS-5)的旋转台上，于≤10-5mbar的真空状态下作铂-碳喷镀。喷镀参数调整为：铂珠直径D=0.5～1.0mm，铂喷射角40°、碳喷射角90°，喷射源距12cm；以投影或旋转(60r/min)方式先后喷镀铂和碳；取出玻片，用刀片在铂-碳复型膜上轻划出线距约2mm的网格，滴1滴3%氢氟酸于复型膜表面，使膜易于从玻片上剥脱；将玻片以锐角插入双蒸水中，使膜漂浮于水面，用细玻棒或白金耳环捞移复型膜，双蒸水洗2～3次；入次氯酸钠腐蚀液≥60min(必要时换1次腐蚀液)，移入双蒸水漂洗3次；200～400目铜网捞膜，避尘晾干待透射电镜观察。
7. 扫描电子显微镜对照制样和观察
按常规方法操作［4］：活精子贴片经系列酒精脱水，临界点干燥，离子溅射镀金，日立扫描电子显微镜S-520观察。
以上实验共重复5次，每次每组制备2平行样(2玻片)，每片观察≥50个精子。
结 果
在透射电子显微镜(TEM)下观察，可见各组精子表面超微结构各具特点。(1)正常组：精子表面复型形态完整，立体感强，呈浮雕状，精子头部分区明显，顶体后环(post－acrosomal ring,PAR)和核后环(post－nuclear ring,PNR)十分清楚，顶体前区与赤道段(equatorial segment, ES)之间的界限较明显，甚至可见质膜颗粒(图1)；与放大倍数相近的SEM图像(图4)比较，可以观察到更丰富的细节、图像更加清晰。尾部各段结构特征性强，中段的螺旋状线粒体、主段的肋柱(rib column,RC)和纵行的拉链状结构(zip structure,ZS)以及末段等超微结构均清晰可辨(图2，3)。(2)获能组：精子形态分为两类，一类与正常组形态相同，另一类约半数以上精子，顶体区质膜局部呈山嵴状隆起，形成网络状形貌，顶体前区与赤道段之间界限消失(图5)；(3)AR组：精子形态分为3类，上一页 [1] [2] [3] 下一页
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