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脓毒血症时大鼠心脏G q 11的变化 |
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王岩眉△ 吴立玲 克拉拉 王 瑶
G蛋白是连接多种细胞膜受体与效应器之间信号转导的重要蛋白质。其中Gαq/11是调节肌醇磷脂信号转导途径的关键物质。脓毒血症往往导致不同程度的心功能障碍，其发生又可促进脓毒血症的进展与恶化。有研究表明，内毒素休克大鼠心肌细胞蛋白激酶(protein kinase C,PKC)活性升高。但对肌醇磷脂信号转导系统的上游信号分子Gαq/11 蛋白的研究尚未见报道。本实验以大鼠腹膜炎脓毒血症为模型，观察心脏Gαq/11蛋白的变化，以探讨脓毒血症时肌醇磷脂信号转导系统的功能变化及其在心功能障碍中的发病学意义。
材料和方法
(一)动物模型：健康雄性Wistar大鼠，体重200～250 g(本校实验动物中心提供)。参照Wichterman等的盲肠结扎穿孔法(cecal ligation and puncture,CLP)复制大鼠腹膜炎脓毒血症模型。动物随机分为3组：(1)假手术(sham operation，S)组（n=6）：除不进行盲肠结扎穿孔外，余同脓毒血症组；(2)早期脓毒血症(early sepsis,ES)组(n=6): CLP术后9 h，20％乌拉坦(0.5 mL/100 g体重)ip麻醉，经右颈动脉插管,记录平均动脉压(MAP)，心室压力最大上升和下降速率(±dp/dt max)。 测量后速取心脏, 4℃生理盐水洗去血液，滤纸吸干后-20℃保存；(3)晚期脓毒血症 (late sepsis, LS)组(n=6)：CLP术后18 h，测定上述指标并取出心脏。
(二)差速离心法制备大鼠心肌细胞膜：将心脏剪碎，加10倍体积Buffer A (10 mmo1/L Tris-HCl, l mmo1/L EDTA, 250 mmol/L蔗糖，pH7.4)。用内切式匀浆器(ZS83-1型)20 s×3制备心肌匀浆液，1 000×g,4℃离心10 min，收集上清平衡后20 000×g，4℃离心40 min，弃上清，沉淀悬浮于Buffer A中，分装后-20℃保存。
(三)丙二醛(MDA)含量的测定：Lowry氏法测定心肌细胞膜蛋白含量。硫代巴比妥酸比色法测量MDA含量。
(四)免疫印迹法测定心脏Gαq/11含量：10％ SDS-PAGE分离膜蛋白，25 V，10 h将蛋白转移至硝酸纤维素膜，5％脱脂奶粉/PBS进行非特异性封闭。加入1∶125抗Gαq/11抗体(Santa Cruz Biotechnology,Inc产品，购自北京中山生物制品有限公司)4℃过夜，PBS冲洗后，加入1∶2500辣根过氧化物酶标记的Ⅱ抗，25℃孵育1h。冲洗后加入化学发光剂(购自Amersham公司)进行曝光。应用LEICA Q550 IW图像分析系统对所得区带进行扫描 。以假手术组动物Gαq/11积分光密度为100％，与脓毒血症组进行比较。
(五)统计处理：全部数据用均数±标准差(±s)表示，采用One-way ANOVA计算机软件进行统计分析。
结果
(一)血液动力学变化：ES、LS时MAP没有明显变化。±dp/dtmax在ES时变化不明显，而LS时明显降低(见表1)。
表1 脓毒血症大鼠血液动力学、心脏 MDA含量和Gαq/11的变化
Tab 1 Changes of hemodynamic parameter and heart MDA levels and Gαq/11 during rat sepsis (±s ，n=6)
S ES LS
MAP(kPa) 14±2 15±1 15±1
+dp/dtmax(kPa/s) 991±238 914±138 587±380*
-dp/dtmax(kPa/s) 993±178 976±248 614±328*
MDA(nmol/mg pr) 7.9±2.4 13.9±3.4* 19.3±3.4**
Gαq/11 100 116&pl[1] [2] 下一页
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