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备用根大鼠脊髓后角组织神经营养活性物质的分离纯化和生物活性测定 |
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chromatography; Neurotrophic active substance
1958年，Liu和Chambers［1］创建了备用根动物模型，即切断成年猫脊髓一侧数条背根，但保留其中的一条背根(备用根)，并观察到备用根初级传入纤维能够在脊髓后角发生侧支出芽。因此首次发现成年哺乳动物中枢神经系统(CNS)在损伤后具有修复能力，从而提出了CNS具有可塑性的新概念。随后几十年，许多学者的研究都证实在成年哺乳动物部分去除传入纤维支配的脊髓内来自于背根的初级传入纤维可发生侧支出芽，并重建突触联系［2～4］。据最近的研究发现［5］，部分去传入纤维支配的脊髓后角组织含有神经营养活性物质，其分子量约在40～78 kD之间。因此推测这可能是引起初级传入纤维在脊髓后角内侧支出芽和突触重建的重要因素之一。但现在还不清楚备用根大鼠脊髓后角组织提取液40～78 kD的蛋白质组分中究竟是哪种分子量蛋白质具有神经营养活性作用?为了寻找这种物质，本实验在以上研究的基础上，利用Superdex G-75 prep grade凝胶层析以及高效液相色谱(HPLC)等蛋白质分离纯化技术，进一步分离纯化备用根大鼠背根切断侧脊髓后角组织提取液，以期获得某种神经营养活性物质，为深入探讨引起脊髓可塑性变化的分子基础提供实验依据，这将有助于了解在神经系统发育过程中某一神经通路建立所涉及的化学因子以及损伤后的修复机制。
材料和方法
1.备用根模型动物的制备
用体重为180～200 g的雄性SD大鼠100只，按前述方法进行备用根模型手术［5］，即切除左侧L1～L3、L5和L6背根和背根节(DRG)，保留L4背根(备用背根)。术后动物存活5d。
2.脊髓后角组织提取液的制备
用击毙法处死术后存活5d的备用根大鼠，以脊髓横断面中央管作为前、后角的分界线，分别切取L1～L6脊髓节段手术侧和非手术侧脊髓后角组织。每300 mg的后角组织加入2 ml 10 mmol/L PBS(pH7.0)，在高速匀浆器内匀浆，5 000 r/min，匀浆3 s；离心10 min，1 200 r/min。收集上清液，即为手术侧和非手术侧脊髓后角组织提取液，用于蛋白质浓度测定、生物活性检测、凝胶层析和电泳分析。
3. Superdex G-75 prep grade凝胶层析
将Superdex G-75 prep grade(Pharmasia产品)装入洁净的层析柱(70 cm×1 cm)，用洗脱液10 mmol/L PBS(pH7.0)平衡层析柱48h后，加入2 ml的备用根大鼠手术侧脊髓后角组织提取液(样品液)，然后用10 mmol/L PBS洗脱。流速每管2 ml，15 min，4℃。分部收集各峰值处的洗脱液，经滤膜超滤浓缩后，用于蛋白质浓度测定、生物活性检测、HPLC层析和电泳分析。
4. HPLC层析
将凝胶层析得到的具有生物活性的洗脱液(活性峰)，加入到HPLC仪(6000 A型，Waters Millipore公司，USA)的蛋白质PAK 200SW型柱(300mm×8mm)中，上样量为300μl。洗脱液为10 mmol/L PBS(pH7.0)，柱温18℃，洗脱液速度为0.2 ml/min。紫外检测器441的检测波长为280 nm，数据处理系统为WDL-95色谱工作站(国家色谱研究中心)。按洗脱峰收集各洗脱液，然后冷冻干燥，用于蛋白质浓度测定、生物活性检测和电泳分析。
5.考马斯亮蓝法测定样品液的蛋白质浓度
配制5种标准浓度的牛血清白蛋白(单位：mg/L)10、20、30、40和50，以空白管调零。考马斯亮蓝G-250显色。在595nm波长下测出A值，绘制标准曲线［6］。各级样品液浓度可从标准曲线上查知。
6.脊髓后角组织提取液各级样品液的生物活性检测
6.1 制备脊髓后角组织提取液各级样品液的培养液：以各级最低蛋白质浓度的样品液为基准，将同级的样品液稀释成相同的蛋白质浓度。然后将样品液用针头滤器过滤除菌后，按照1份样品液，加入2份培养液的比例进行稀释。培养液为DMEM，其中补加1／3胎牛血清、葡萄糖1.5 g/L、NaHCO3 2.2 g/L、青霉素105 μg/L和链霉素0.1 g/L。按同样方法将10 mmol/L PBS代替上述样品液制备对照组培养液。
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