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转基因小鼠人载脂蛋白AI基因表达对血浆高密度脂蛋白的影响 |
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ppropriate for studying the effect of apoAI on lipid metabolism and the mechanism combating atherogenesis.
【Key words】 Mice, transgenic Apolipoprotein A-I Lipoproteins, HDL
(Natl Med J China,1998, 78：531-533)
研究apoAI基因表达调节血浆高密度脂蛋白(HDL)水平的代谢机理，对进一步寻找冠心病的易感基因具有重要的意义。目前，apoAI的合成与调节血浆HDL水平的机制尚难于直接在人体内观察。本研究应用含小鼠MT-I启动子的重组人apoAI基因建立了转基因C57BL/6小鼠模型，拟探讨apoAI基因表达对HDL水平的调节机制。
材料和方法
一、材料
1.动物：转人apoAI基因小鼠为本室构建［1］。正常C57BL/6小鼠购自中国药品鉴定所。本实验小鼠8周龄，24只，雌雄各半，体重20～22 g。
2.主要试剂和仪器:限制性内切酶EcoRI、PstI及RNase，随机引物标记试剂盒(美国Promega公司)，蛋白酶K(德国Merck公司)；apoAI，总胆固醇(TC)，甘油三酯(TG)，HDL测定试剂盒(均为北京中生公司产品)；硝酸纤维素膜(美国Bio-Rad公司)，光密度扫描仪(英国Pharmacia公司)。其它试剂均为国产分析纯。
二、方法
1.DNA制备及Southern blot分析：转基因雌性首建小鼠与正常C57BL/6雄性小鼠交配，建立以C57BL/6为背景的转基因小鼠系。取3～4周仔鼠尾2～3 cm，微火烧灼去毛。剥离皮肤组织，剪碎，按Sambrook等［2］方法提取基因DNA。每个样本取20 μg DNA，PstI酶切，0.8％琼脂糖凝胶上电泳，转移至硝酸纤维素膜上。用随机引物法标记探针进行Southern杂交。
2.RNA制备及Northernblot分析：按Chomczyski等［3］所述方法，从动物不同组织包括肝、小肠、肾、心、脾、肺和脑中提取总RNA，测光密度值(A)260/A 280大于1.80。取20 μg RNA在甲醛－琼脂糖凝胶上电泳，转移至硝酸纤维素膜上。用随机引物法标记人和鼠apoAI探针进行Northern杂交。人apoAI探针为2.2 kb PstI片断，小鼠apoAI探针为0.640kp片断。
3.血浆apoAI和血脂水平测定：血浆apoAI水平用免疫透射比浊法测定。血浆TC、TG及HDL水平用酶学方法测定。
4.饮食及血样收集：取转基因鼠和正常鼠置于代谢笼中，保持12小时明暗循环，自由进食饮水,先给动物含25 mmol/L硫酸锌水溶液2周。动物禁食过夜，次晨用阿佛丁麻醉后在眼眶后静脉丛取血于含6 μl 0.5 mol/L依地酸的试管中，3 000 r/min，15分钟，分离血浆，4℃保存备用。
5.统计学分析：结果以均数±标准差表示，采用student’s t检验，并作简单相关分析。
结 果
一、转人apoAI基因的整合
首建雌鼠与正常C57BL/6雄鼠交配繁殖，产生以C57BL/6鼠为遗传背景的人apoAⅠ转基因鼠系。Southern blot分析证实转基因鼠整合人apoAⅠ基因约4～15拷贝(图1）。
图1 Southern Blot分析
整合有人apoAⅠ基因的小鼠可稳定遗传。雌性首建鼠繁殖3代共生86只仔鼠，其中第一代（G1）13只，有5只携带目的基因，而G2和G3代仔鼠约有50％整合有人apoAI基因，且性别差异无显著意义。提示，转入的人apoAI基因为单位点整合，且为常染色体遗传。
二、人apoAI基因表达
Northern blot分析表明，人apoAI mRNA主要在转基因鼠肝和肾中表达，而小肠等其它组织均未检出。经锌诱导后，转基因鼠肝、肾和小肠中人apoAImRNA水平明显增高，其中肝和肾中mRNA水平较诱导前分别增加66％和21%。对照组小鼠则无人apoAImRNA表达（图2）。
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