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诱导型一氧化氮合酶选择性抑制剂对大鼠免疫性肝损伤的影响 |
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li participates in rat hepatic injury mechanism.
【Key words】 Liver diseases Nitric oxide Enzyme inhibitors
(Natl Med J China, 1998, 78：540-543)
由诱导型一氧化氮合酶(iNOS)所大量产生的一氧化氮(NO)，主要作为细胞免疫和细胞毒性的效应分子，在多种感染性及自身免疫性疾病的发病机制中起重要作用［1］。采用药物对iNOS同工酶的活性及表达环节进行选择性调控，可望为多种疾病的治疗开辟新的途径。我们已证实体外分离培养的大鼠肝细胞可在细菌内毒素(LPS)与细胞因子的诱导下生成大量NO［2］，但免疫性肝损伤与NO诱生的相关性及选择性抑制iNOS对肝损伤的影响尚未得到证
本研究旨在探讨大鼠免疫性肝损伤与iNOS基因表达及NO生成之间的相互关系，药物对NO生成的影响，以确定NO在肝损伤中的作用和诱生规律以及药物作用的机制，从而为多种iNOS诱生相关疾病的治疗提供实验依据。
材料与方法
1.材料：Wistar雄性大鼠（200±20 g），由本校实验动物部提供。胶原酶（Ⅳ型）、细菌内毒素（LPS）、胰岛素、氨基胍、L-精氨酸甲酯(Nω-nitro-L-arginine methyl ester，L-NAME)、地塞米松均为美国Sigma公司产品；放线菌素D为瑞士Fluka公司产品；人重组白细胞介素1(IL-1β)、干扰素(IFN-γ)及肿瘤坏死因子(TNF-α)为北京邦定生物医学公司产品；佐剂用卡介苗(BCG)，购自中国药品生物制品检定所。原位杂交及原位聚合酶链反应检测iNOS mRNA所用探针为生物素标记的cRNA探针，长700 bp左右；原位PCR所用引物为外源性生物素标记的DNA片段,为人MDM2 的一段cDNA长973 bp；以上均由北京医科大学病理学系合成。
2.大鼠免疫性肝损伤模型的制备：大鼠随机分为5组（每组6只），即正常对照组，BCG各剂量组(15、30、50 mg/只)，BCG+LPS组。除对照组外，各组均于尾静脉注射上述剂量的BCG。BCG致敏2周后BCG＋LPS组尾静脉注射LPS(剂量分别为1、10、100 μg/只)。LPS注射4小时后处死各组动物取肝脏，石蜡包埋切片，HE染色，进行肝脏病理组织学检查或对肝细胞分离培养，以检测细胞培养上清中乳酸脱氢酶(LDH)活性（参照文献［3］方法）作为判断肝细胞损伤的生化学指标。
3.大鼠肝细胞原代培养：采用胶原酶灌流-差速离心法［2］对BCG致敏1～2周的大鼠及对照组大鼠肝实质细胞进行分离与纯化，将肝细胞按1×106个细胞*ml-1*孔-1接种于6孔平底培养板，常规培养24小时后，加入LPS与细胞因子(CM)或NOS抑制剂；观察药物量效与配伍关系时，取刺激24小时后的细胞及培养上清；观察时效关系时，取刺激6、12、24及48小时后各时间点细胞及培养上清进行生化测定。
4.细胞培养上清NO生成量测定：取培养上清100 μl，加等量Griess试剂（1%对氨基苯磺酰胺与0.1%N-萘基-乙二胺，5%H3PO4等量混合，临用当天配制），室温放置15分钟后，用酶标仪在540 nm处测定样本吸光度(A)，以亚硝酸钠作标准曲线计算培养上清NO2含量，以NO2含量表示NO生成量。
5.原位杂交：(1) 标本制备：取原代培养对照组及免疫性损伤组肝细胞涂片或细胞悬液涂布于硅烷化载玻片(DAKO公司)，4%多聚甲醛固定，0.2 mol/L盐酸处理10分钟后，蛋白酶K(10 μg/ml)消化细胞涂片，0.1%甘氨酸中止消化，4%多聚甲醛再固定，上行系列乙醇脱水；(2) 杂交：每片滴加杂交液25 μl(含50%去离子甲酰胺5 μl；NOS RNA探针2 μl；鲑精DNA 1 μl；1 mol/L DTT 1 μl；50×Denhardt′s液2 μl；50%硫聚葡糖胺2 μl；20×SSC 4 μl，对照片省去)；(3) RNA探针于80℃变性15分钟；(4) 加封口膜，42℃保温过夜；(5) 杂交后洗涤：系列标准柠檬酸-氯化钠液(2×、1×、0.2×SSC)洗涤，1∶20马血清蛋白室温封闭40分钟；(6) 杂交后检测: 亲和素-生物素-过氧化物酶(AB上一页 [1] [2] [3] 下一页
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