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共焦镜同时检测细胞内Ca2 和pH的变化 |
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细胞受各种因素作用时，胞内Ca2+和pH发生变化〔1〕，不过由于缺乏能同时检测胞内Ca2+和
pH动态变化的方法，二者之间的关系仍不很清楚。近年来，随着激光扫描共聚焦显微镜技术和荧
光探针的开发利用〔2〕，新一代的胞内游离Ca2+和pH荧光探针fluo-3/AM和SNARF-1/AM被分别用
于胞内游离Ca2+和pH变化的检测〔3,4〕。根据fluo-3/AM和胞内游离Ca2+结合后在波长530 nm处
荧光强度随游离Ca2+浓度升高而增强，而SNARF-1/AM的荧光强度在波长>605 nm时随胞内pH升高
而增强，它们的激发波长均为480 nm〔5,6〕以及fluo-3/AM的荧光强度不受SNARF-1/AM影响〔3〕
等特点，我们设计了本实验，拟利用fluo-3/AM和SNARF-1/AM混合物同时着染巨噬细胞，以观察
巨噬细胞内游离Ca2+和pH的动态变化。
材 料 和 方 法
一、主要材料
带双检测器的激光扫描共聚焦显微镜（ACAS570），美国Meridian 公司生产。fluo-3/AM、
SNARF-1/AM，美国Molecular Probes Inc产品。RPMI－1640、Hepes购于Sigma公司。小牛血清，
浙江杭州四青生物材料厂制品。其它试剂均为分析纯。
二、细胞培养
体重20 g左右雌性正常昆明小鼠，按照鄂征等人的方法〔7〕取腹腔巨噬细胞，以5×105个/cm2
的浓度接种于改装35 mm Petri细胞培养皿底部的盖玻片上，用含10％小牛血清的RPMI－1640
培养于37oC含5％CO2的孵育箱内。
三、荧光探针标记
吸除培养皿内的培养液，用Hepes缓冲盐溶液洗三次，分别在不同培养皿中滴入10 μmol/L
fluo-3/AM、10 μmol/L SNARF-1/AM和含10 μmol/L fluo-3/AM和10 μmol/L SNARF-1/AM的混合
液0.3 ml，37oC孵育30～60分钟，吸除染液，用Hepes缓冲盐溶液洗3次，再加入0.5 ml Hepes缓
冲盐溶液。
四、ACAS570检测胞内Ca2+和pH
将培养皿置于ACAS570载物台上，选用40×物镜，7％滤光片，确定激发光波长为488 nm，
进入Ratio－Generic－Image Scan程序，打开检测器1（最适发射波长530 nm）和检测器2（最适发
射波长大于605 nm），建立文件，作预扫描后选定最佳扫描参数，对选定视野扫描并存储所获
信息。主要扫描参数如下：Pinhole 1 600μm, PMT1 70%, PMT2 70%, Scanning Strength 20%, Laser
Power 10 mW。
五、单检Ca2+或pH时按张薇等人的方法〔4〕，分别打开检测器1或2进行。
六、分析
双检分析进入Ratio－Generic－Image Analysis程序，调入分析文件，得出同时反映细胞内Ca2+
和pH动态变化的荧光强度变化曲线。单检分析进入Kinetics－Image－Analysis程序，分别调入分
析文件，得出各自反映细胞内Ca2+或pH动态变化的荧光强度变化曲线。
结 果
一、细胞荧光图像
图1和图2分别为检测器1和检测器2同时打开时检测到的fluo-3/AM和SNARF-1/AM的细胞荧光
图像。图1显示仅检测器1检测到fluo-3/AM所发荧光，同样，图2显示仅检测器2检测到SNARF-1/AM
所发荧光。
二、单测巨噬细胞内Ca2+和pH的变化
单检结果显示，小鼠巨噬细胞未受到刺激时，fluo-3/AM和SNARF-1/AM荧光强度不变，巨
噬细胞内的Ca2+和pH稳定；加入维拉帕米（终浓度1μmol/L）后200 sec，fluo-3/AM的荧光强度
下降了0.45，SNARF-1/AM的荧光强度下降了0.2；加入肾上腺素（终浓度1μmol/L）后200 sec，
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