细胞凋亡检测的研究进展及其与疾病的关系

李晓军　武建国

　　细胞凋亡(Apoptosis)是细胞生命周期中的重要组成部分。Apoptosis一词源于希腊文，指秋天树叶凋落，它是一种不同于坏死的由基因调控的细胞主动性死亡过程，可见于胚胎发育、组织发生、组织分化、细胞癌变等过程［1］。在免疫学上，细胞凋亡参与介导胸腺及周围T细胞耐受，细胞毒T细胞介导靶细胞溶解等过程［2］。细胞凋亡是当今医学界研究的热点之一，已渗透到生物学、基础医学、临床治疗和药物筛选等许多领域。对细胞凋亡(Ap)机制的探讨，为临床上研究某些疑难病症如AIDS、肿瘤、自身免疫病等发病机制及治疗策略开辟了新的领域。
　　许多因素可诱导凋亡或抑制凋亡，如激素、细胞因子、抗体、超抗原、粘附分子、免疫细胞(K、NK)、化疗药物、致癌药、生长因子缺失、高温、放射线等，根据靶细胞不同，某些物质可能有双重作用。细胞内与Ap有关的基因可分两类：①诱导凋亡基因：野生型P 53、Ced-3、Ced-4、c-myc、ICE家族、Fas/Apo-1、reaper、hid等；②抑制凋亡基因：Bc1-2、Ced-9、V-raf、EBV-CMP 1等［3、4］。目前判断Ap的方法很多，主要依据细胞形态学改变、细胞膜通透性变化、DNA片段化等一系列指标。

1　细胞凋亡的形态学及生化特征
　　细胞凋亡与坏死不同，表现在发生机制、形态学和生物化学等各个方面。细胞坏死亦称病理性死亡，是缺氧、代谢毒物等有害因子作用于细胞引起的炎症反应，早期改变主要是细胞肿胀、质膜破裂、溶酶体酶释放，最终导致细胞和组织的炎症反应；而凋亡则是发生于正常生理状态下的细胞死亡，其始发因素往往源于细胞内外的死亡信息，通过信息传递而导致某些基因的转录、翻译，这些蛋白质最终作用于细胞引起Ap。Ap主要表现在细胞萎缩，核染色质致密，常聚集于核膜上，呈境界分明的新月形或块状小体，胞膜皱摺或出泡(blebbing)，完整细胞膜将细胞器及碎片包裹成多个小体，形成凋亡小体。凋亡小体被邻近吞噬细胞吞噬，不引起周围组织的炎症反应［1、5］。细胞Ap的生化特征是基因组DNA发生有规律的不可逆性降解，核小体之间的连接部双螺旋DNA被特异性Ca2＋/Mg2＋依赖的DNA内切酶断裂成含180～200 bp的多倍寡核小体片段，在含EB的琼脂糖电泳上呈典型的梯状(ladder)条带。

2　细胞Ap常用的检测方法
2.1　细胞形态学观察法　目前认为凋亡细胞特异性的形态学改变是判断Ap最可靠的指标［6］。
2.1.1　光学显微镜　组织切片或细胞涂片经HE或甲基绿-派诺宁染色后，在油镜下观察，Ap细胞体积缩小，胞质浓缩，核染色质密度增高，呈致密浓染的块状或颗粒状。由于光镜不能早期发现Ap细胞核及细胞器的改变，故常不作为单独判断Ap的指标。
2.1.2　电子显微镜　电镜下观察，Ap细胞染色质固缩，常聚集于核膜上呈境界分明的块状或新月形小体，初期细胞可见完整的细胞器，细胞膜完整，凋亡小体形成。目前一致认为，电镜下获得凋亡细胞特征性的形态学改变是判断细胞Ap的最可靠依据。
2.1.3　荧光显微镜　对体外培养的活细胞经荧光色素处理，可在荧光显微镜下观察细胞形态改变。常用荧光色素有①吖啶橙；②Hoechst 33258或Hoechst 33342；③碘化丙啶(PI)；④溴乙锭(EB)。前两种可分别进入活细胞和死细胞，而后两种荧光素仅能进入死细胞。不同的荧光素使核着染不同颜色的荧光，正常细胞呈均匀荧光染色，而Ap细胞呈致密浓染的颗粒状或块状荧光。荧光镜检查简便易行，但定量定位均不如后面提到的流式细胞计数法可靠。
2.2　反映凋亡细胞膜改变的方法
2.2.1　染料排斥法　除了电镜能反映细胞膜完整性外，还可用染料排斥法，如台盼蓝、PI等。坏死细胞膜破损，被染料着染；而Ap细胞膜完整，不被着染，但在体外培养的细胞最终也会发生继发性坏死，因此，此法不能单独用来判断Ap。
2.2.2　流式细胞仪观察法　另一种方法是判断胞质膜的不对称性。在正常细胞膜上，磷脂酰丝氨酸基团(PS)位于胞质侧；而在细胞凋亡早期，膜上此基团则转向胞外侧，以利于被吞噬。因此，磷脂酰丝氨酸基团位置的改变，可作为凋亡细胞一个标志。膜联蛋白中的Annexin Ⅴ，即锚定蛋白，是一种Ca2＋依赖的磷脂结合蛋白，即锚定蛋白(anchorin)，与磷脂酰丝氨酸有强亲和力。将此蛋白质标记上荧光素(FLUOS或AlexaTM 568)，与PI(或BOBOTM－1)一起处理悬浮细胞，通过流式细胞仪即可观察细胞Ap情况；因PI选择性与坏死细胞而不与凋亡细胞结合，可将凋亡细胞和坏死细胞区别开来。将

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