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血样本影响ELISA试验的原因分析及解决办法 |
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血样本影响ELISA试验的原因分析及解决办法
ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、 牽9体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。由于抗原、抗体的反应在一种固相载体——聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行，每加入一种试剂孵育后，可通过洗涤除去多余的游离反应物，从而保证试验结果的特异性与稳定性。
ELISA方法被广泛应用于各种抗原和抗体测定。但ELISA测定中影响因素较多，而且其操作中有一定的技术要求，在临床检验中除正常反应外，有时常可见到一些错误结果(即假阳性或假阴性结果)。引起ELISA测定错误结果的原因主要有：①标本因素；②试剂因素；③操作因素。本文就样本因素对ELISA测定的影响做如下讨论。
血清是最常用的ELISA标本，血浆一般可视为与血清同等的标本，标本引起的假阳性和假阴性结果主要是干扰性物质所致，分为内源性物质和外源性物质两种
1 内源性物质 有人认为大约40％的人血清标本中含有非特异性干扰物质，可以不同程度影响检测结果。常见的干扰物质有：类风湿因子、补体、嗜异性抗体、嗜靶抗原自身抗体、医源性诱导的抗鼠Ig(s)抗体、交叉反应物质和其它物质等。
1.1 类风湿因子 人血清中IgM、IgG型类风湿因子(RF)可以与ELISA系统中的捕获抗体及酶标记二抗的FC段直接结合，从而导致假阳性。解决该情况的办法是：①用F(ab)2替代完整的IgG；②标本用联有热变性(63℃，10min)IgG的固相吸附剂处理(将热变性IgG加入到标本稀释液中同样有效)；③检测抗原时，可以用2-巯基乙醇等加入到标本稀释液中使RF降解。
1.2 补体ELISA系统中固相一抗和标记二抗过程中，抗体分子发生变构，其FC段的补体C1q分子结合位点被暴露出来，使Clq可以将二者连接起来，从而造成假阳性。解决的办法是：①用EDTA稀释标本；②用53℃，10min或56℃，30min加热血清使C1q灭活。
1.3 嗜异性抗体 人类血清中含有能与啮齿类动物(如鼠等)Ig(s)结合的天然嗜异性抗体，可将ELISA系统中一抗和二抗连接起来，也能造成假阳性。解决的办法是：可在标本稀释液中加入过量的动物Ig(s)，但加入量不足或亚类不同时无效。
1.4 嗜靶抗原的自身抗体抗甲状腺球蛋白、抗胰岛素等嗜靶抗原的自身抗体，有时能与靶抗原结合形成复合物，在ELISA方法中均可干扰抗原抗体测定结果。为避免以上情况出现，解决的办法是：测定前需用理化方法将其解离后再测定。
1.5 医源性诱导的抗鼠Ig(s)抗体临床开展的用鼠源性CD3等单克隆抗体治疗，用放射性同位素标记鼠源性抗体的影像诊断及靶向治疗等新技术，均有可能使这些病人体内产生抗鼠抗体：另外，被鼠等啮齿类动物咬伤的病人体内也可以产生抗鼠Ig(s)抗体。这些病人ELISA测定时均可产生假阳性。解决的办法是：测定抗原时，在标本中加入足量的正常鼠lg(s)，从而克服由于上述原因造成的假阳性
1.6 交叉反应物质类地高辛、类AFP样物质等，是与靶抗原有交叉反应的物质。在用多抗测定抗原时对测定结果影响不大，但在用单克隆抗体测定抗原时，如果交叉抗原决定簇正好是所用单克隆抗体相对应的靶决定簇时，也会出现假阳性结果。
1.7 标本中其它成分的影响血清脂质过高、胆红素、血红蛋白及血液粘度过大等，均对ELISA测定结果有干扰作用。
2外源性物质 外源性物质常常是由于用于ELISA测定的血标本的采集、贮存等不当所致。如标本溶血、标本被细菌污染、标本贮存过久、标本凝集不全和采血管中添加物等影响。
2.1 标本溶血由于各种人为原因引起的标本溶血，均可因红细胞破坏溶解时释放出大量具有过氧化物酶活性的血红蛋白，在以辣根过氧化物酶为标记的ELISA测定中，会导致非特异性显色，干扰测定结果。为克服上述干扰作用，标本采集时必须注意避免溶血。
2.2 标本受细菌污染因菌体中可能含有内源性辣根过氧化物酶，因此，被细菌污染的标本同溶血标本一样，亦可产生非特异性显色而干扰测定结果。
2.3标本保存不当 在冰箱中保存过久的标本，血清中IgG可聚合成多聚体、AFP可形成二聚体，在间接法ELISA测定中会导致本底过深、甚至造成假阳性；标本放置时间过长(如一天以上)，有时抗原或抗体免疫活性减弱，亦可出现假阴性。为克服上述干扰，ELISA测定的血清标本宜为新鲜采集；如不能立即测定，5天内测定的血清标本可存放于4℃，1周后测定的血清标本应低温冻存；冻存后融解的标本，蛋白质局部浓缩，分布[1] [2] 下一页
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