嗅刺激诱导的cfos原癌基因在大鼠脑内的表达嗅刺激诱导的cfos原癌基因在大鼠脑内的表达

嗅刺激诱导的c-fos原癌基因在大鼠脑内的表达

杨天祝　葛莉　万选才

　　摘　要　目的　为了解嗅刺激引起中枢神经系统兴奋的区域及程度。方法　以醋酸戊酯多次刺激大鼠，1h后灌注固定处死动物。以c-fos探针的ABC免疫细胞化学法，观察分析c-Fos蛋白在大鼠脑内标记区。结果　中枢系统内c-Fos蛋白标记区十分广泛，尤以脑桥以上脑区为多。除嗅觉通路诸结构外，边缘系统内也有广泛标记，提示存在嗅情绪反应、嗅内脏与嗅躯体反应及嗅记忆等多神经回路的活动。其次，与注意及中枢功能状态调节有关的脑区也有广泛标记。上丘深层、下丘及脑桥核等为强标记，推测与感觉和运动的整合活动有关。结论　用嗅刺激诱导c-fos原癌基因表达，确可证实一种特异性嗅刺激可引起大鼠中枢神经系统内泛脑网络上的广泛运动。

　　大鼠属嗅敏动物，其嗅脑和边缘系统相当发达。在选择配偶、御敌、觅食及其他探究性行为当中，大鼠嗅觉发挥着十分重要的作用。一种感觉刺激进入中枢神经系统(CNS)后，决非仅激活相应的感觉系统，而是涉及十分广泛的脑区和神经回路，即引起泛脑网络的多重活动［1］。以嗅球注射HRP显示嗅球传入及传出联系，不能全面反映CNS内整个神经活动的状况［2］。而以c-fos原癌基因作为神经活动与形态定位相结合的表达水平探针，其空间分辨力可达细胞水平［3～5］。本研究在大鼠体内以嗅刺激诱导c-fos原癌基因表达，试图以免疫细胞化学法观察与嗅刺激相关的脑区，分析其涉及的各种神经回路，全面认识嗅刺激引起的多重神经活动。

1　材料和方法
　　16只SD大鼠，雄性，体重150 g左右。其中嗅刺激实验组8只，嗅刺激物为浸透醋酸戊酯(香蕉香精)的棉球；对照组8只给予蒸馏水棉球，其中4只动物免除一抗步骤。
　　为避免无关刺激的干扰，预先彻底清洗鼠笼，将鼠放置在安静而无强光刺激的环境中，1 h后开始嗅刺激。嗅刺激时，先轻轻将刺激物放置在鼠笼顶刺激60 s，然后移除嗅刺激物2 min；照此反复嗅刺激10次。
　　最后一次嗅刺激后60 min(c-fos表达高峰期)［6］，经升主动脉输入灌注固定液处死动物。在2%戊巴比妥钠(60 mg/kg)腹腔麻醉下，经升主动脉输入冲洗液(0.05 mol/L生理盐水磷酸缓冲液)100～150 ml，接着输入灌注固定液(4%多聚甲醛的0.05 mol/L磷酸缓冲液，pH 7.4)800ml，随即取脑和颈髓，置于固定液内过夜。经蔗糖磷酸缓冲液防冰晶处理，行冰冻切片，厚度为50μm。兼取冠状切片与矢状切片。
　　免疫细胞化学实验按切片漂浮法ABC程序进行。一抗为抗c-fos的绵羊多克隆抗体(美国CRB公司)。经预试验最佳一抗稀释度为1∶6 000。二抗与三抗使用Vectastain Elite ABC药盒。在一抗孵育前，以正常兔血清封闭非特异性蛋白结合位点1 h。在三抗孵育前，以3‰ H2O2的甲醇液淬灭内源性过氧化酶活性20 min。一抗孵育时间为70 h(4℃)+2 h(室温)，二抗和ABC三抗孵育时间均在2 h以上。二抗与三抗稀释依药盒说明进行。在DAB呈色后贴片，以0.25% 的硫堇复染，常规脱水、透明及封片。c-Fos蛋白标记表现为深棕色细胞核。依大鼠脑图谱［7，8］识别标识的神经结构。依标记神经元胞核数目和呈色强度，分为极强(++++)、强(+++)、次强(++)及弱(+)四级。

2　结果
　　嗅刺激引起动物的一般行为反应　给予生理盐水棉球刺激，未引起动物注意及行为反应。给予醋酸戊酯棉球刺激，动物反应虽有个体差异，但均有明显的行为改变。有的动物从困倦中惊醒，以前爪洗面，打喷嚏，竖起躯体探究刺激物，然后远离刺激物；有的动物在第三次嗅刺激时才引起注意，但无明显探究行为。 在后几次嗅刺激时，动物正常饮水或进食，同未给刺激物的间歇期行为。
　　嗅刺激诱导c-fos在大鼠脑内的表达　c-Fos蛋白在CNS内的表达区域十分广泛。在低倍镜下观察矢状切片，嗅觉传导通路诸灰质结构均有强标记；大脑皮质额叶前部标记细胞浓密，而背侧海马仅稀疏标记；下丘脑标记区十分广泛但多不浓密，背侧丘脑总体标记密度明显不如下丘脑，大部见于其背侧边缘区；上丘深层、下丘及脑桥核的标记浓密，而脑桥以下标记结构明显减少。在冠状切片上，大脑半球内侧皮质、嗅周皮质以及杏仁核区的标记十分浓密。

Fig 1　Diagram of expressed structures of c-Fos protein induced by an olfactory stimulus

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