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氟对骨形态发生蛋白的直接作用 |
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3．植入物ALP、ACP活性分析：剪下部分植入物，称重、匀浆，离心后取上清，按文献［4］的方法测定ALP和ACP活性，底物为0.02 mol/L的β-硝基苯磷酸盐，测ALP的反应液pH值为9.3，测ACP的反应液pH值为5.0，37℃反应30 min，用0.1 mol/L的NaOH终止反应，400 nm处测吸光度，酶活力以u/mg组织（湿重）表示。
4．植入物钙含量测定：将以上剩下的植入物称重，经混酸消化后用原子吸收分光光度法测定钙含量，以mg/g组织来表示植入物中的钙含量。
结果
1．纯化BMP和加氟BMP诱导成骨的组织学比较：在纯化BMP植入物切片中，第7天出现了大量软骨细胞，第12天软骨细胞部分溶解，伴随血管侵入，成骨细胞分化、增生，发生软骨内成骨，到第17天有大量的新骨形成及初步骨髓发育，第21天交织骨和不规则骨髓腔。与纯化BMP比较，加氟BMP植入物也经历了类似的过程，植入物中亦有大量的软骨细胞出现，但软骨细胞的数量较纯化BMP植入物略少，第12天时亦可观察到软骨内成骨，但成骨细胞所占的比例较纯化BMP为高，第17天亦有大量新骨形成，第21天可见骨皮质样骨化物及骨髓腔。
2．纯化BMP和加氟BMP在骨诱导过程中ALP及ACP活性分析：从图1可知，在诱导成骨过程中，纯化BMP的ALP在第12天达到高峰，以后很快下降，但加氟BMP的ALP第7天即达到高峰，然后缓慢下降。在诱导早期（第7天），加氟BMP植入物的ALP活性高于纯化BMP（t检验，P<0.05），在诱导中期（第12天），加氟BMP植入物的ALP活性低于纯化BMP（t检验，P<0.05），在诱导中、后期（第17、21天），加氟BMP植入物ALP活性低于纯化BMP（t检验，P<0.05）。从图2可知，在整个骨诱导过程中，加氟BMP植入物的ACP活性均低于纯化BMP，但在诱导早期（第7天）和中期（第12天），两组之间的差异均无显著性（t检验，P>0.05），在诱导后期（第17和第21天），这两组之间的差异有显著性（t检验，P<0.05）。
图1 加氟和纯化骨形态发生蛋白(BMP)
诱导成骨过程中碱性磷酸酶活性变化
图2 加氟和纯化骨形态发生蛋白(BMP)
诱导成骨过程中酸性磷酸酶活性变化
3．加氟BMP与纯化BMP植入物中钙含量比较：从表1可知，在整个骨诱导过程中，加氟BMP植入物的钙含量均高于纯化BMP，但在诱导早期（第7天）和中期（第12天），两者之间的差异无显著性（P>0.05），但在诱导后期（第17天和第21天）两者之间的差异有显著性（P<0.05）。
表1 加氟BMP与纯化BMP植入物中钙含量
(mg/g组织)比较(±s)
植入物 第7天 第12天 第17天 第21天
纯化BMP 0.082±
0.023 0.124±
0.035 0.226±
0.068 0.304±
0.059
加氟BMP 0.096±
0.031 0.149±
0.045 0.370±
0.052* 0.545±
0.087*
*t检验，与纯化BMP相比，P<0.05
讨论
研究氟对BMP的直接作用对阐明氟骨症的发病机制具有意义，我们通过在纯化BMP中加入氟化钠来研究氟对BMP活性的直接作用。由于本研究的目的在于观察氟中毒时氟对BMP的直接作用以阐明氟中毒的发病机制，因此在选择剂量时仅选择了一个能引起氟骨症的较高剂量，氟化钠的加入接近氟骨症大鼠骨组织中所分离出来的BMP中的氟含量（我们先前的实验表明氟中毒大鼠所分离出来的BMP中的氟含量为0.85 mg/mg BMP），结果表明：
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